不同NaCl含量、培养基和微量元素对分枝杆菌SP-3降解菲的影响研究

黄玉杰，张闻，傅晓文，高永超，孔学，郭书海，2，王加宁*

(1.山东省科学院生态研究所，山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250014；2.中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁 沈阳 110016 )

【环境与生态】

不同NaCl含量、培养基和微量元素对分枝杆菌SP-3降解菲的影响研究

黄玉杰1，张闻1，傅晓文1，高永超1，孔学1，郭书海1，2，王加宁1*

(1.山东省科学院生态研究所，山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250014；2.中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁 沈阳 110016 )

研究了分枝杆菌SP-3在不同NaCl含量、培养基和微量元素中降解菲的效果影响。结果表明，分枝杆菌SP-3在NaCl质量分数为1%时对菲的降解率达到最大，为87.41%；菌株在LB液体培养基、改良LB液体培养基和改良的无机盐液体培养基中对菲的降解率都达到了80%以上，三者之间无显著性差异；Fe2+、Zn2+浓度分别在100 μmol/L和5 μmol/L，Mg2+在100 μmol/L时，可以提高菌株对菲的降解能力，而Cu2+随着浓度的增加，能够抑制菌株对菲的降解。研究结果有助于该菌应用于多环芳烃降解的生物技术中，以提高菌株对菲等多环芳烃的降解能力。

菲；微量元素；培养基；降解率；分枝杆菌

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs)是一类广泛分布于环境中的持久性有机污染物，具有致畸、致癌和致突变的作用，给生态环境和人体健康带来潜在的危害[1-3]。PAHs的降解过程包括光解、水解和生物降解等多种途径，其中，生物降解在土壤PAHs降解的过程中发挥着重要作用，越来越受到人们的关注[4-6]。研究表明，环境中对PAHs的降解主要是细菌类，这些菌可以利用菲等四环以下的PAHs作为唯一碳源生长[7-9]。Story等[10]从被PAHs污染的土壤中筛选出一株降解菌Sphingomonassp.GY2B，该菌株能够降解99.8%的菲、萘等四环以下的PAHs。

PAHs生物降解过程中，受到多种因素的影响，包括碳氮源、温度、酸碱度、土壤盐碱度、各种营养成分和微量元素等[11-13]。本实验室分离得到分枝杆菌SP-3，在营养无机盐培养基中对菲的降解率达到了90%以上[14]。本文在对其进行发酵及培养条件优化的基础上，对该菌进行了NaCl含量、菲降解用培养基及不同微量元素方面的研究，为今后该菌的工业化生产提供了理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

本实验中所用的菌株为分枝杆菌SP-3，该菌株的分离及培养见文献[14]。

1.1.2 培养基

LB培养基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH值7.2，121 ℃高压灭菌20 min，备用。

改良LB培养基：上述LB培养基中，NaCl 增加至10 g/L。

固体LB培养基：上述LB培养基中加入10 g/L琼脂。

无机盐培养基：NH4NO31.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 1.0 g/L，CaCl20.1 g/L，FeCl30.02 g/L，pH值为7.0～7.2，121 ℃高压灭菌20 min，备用。

改良无机盐培养基：上述无机盐培养基中添加5 g/L蛋白胨，2.5 g/L酵母粉。

菲培养基的制备：取150 mL三角瓶，灭菌后向每个空瓶中加入5 g/L的菲母液(0.25 g菲溶于50 mL丙酮配置而成)0.4 mL，放入摇床中恒温培养18 h，使其中的丙酮挥发干净。然后将已经灭菌的40 mL无机盐培养基倒入上述含菲的三角瓶中，菲的最终浓度为50 mg/L。

1.1.3 仪器与试剂

Waters Alliance 2695液相色谱仪(美国Waters公司)，Waters SymmetryTMC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Waters公司)；旋转蒸发器RE-52A(上海亚荣生化仪器厂)；高效液相色谱层析流动相所用甲醇为色谱纯(美国Thermo Fisher公司)；实验用水为超纯水(屈臣氏)；二氯甲烷为分析纯(北京化工厂)；对照品菲(美国Supelco公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 菲的标准曲线的绘制

将菲用甲醇稀释成浓度为1、2、4、6、8、10 mg/L 的标准系列，进行液相色谱测定，记录色谱图，以相对应的菲的浓度为横坐标(x)，对应的峰面积为纵坐标(y)，线性回归绘制标准曲线，y=320.37x-12.448，R2=1。

1.2.2 菲的测定

将二氯甲烷按照体积比1:1加入到样品中，摇床振荡30 min，取出后超声10 min，利用分液漏斗进行液液萃取，分离并收集有机相，萃取重复3次。用烘干的无水Na2SO4去除有机相中多余水分，然后抽滤并旋蒸，氮气吹至近干，甲醇定容至10 mL，用高效液相色谱测定样品中的菲含量。色谱条件：流动相为甲醇-水(90:10,V/V)，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，运行时间6 min， 激发波长260 nm，发射波长360 nm，增益8，PDA测波长为249.7 nm。绘制菲的标准曲线，采用外标法，按照下列公式计算菲降解率：

上式中，X为降解率，A为对照培养基中菲浓度，B为接菌培养液中菲浓度。

1.2.3 数据分析

实验数据采用Excel、SPSS软件进行数据统计和分析。

1.2.4 种子液的制备

单菌落接种在LB试管中，30 ℃、160 r/min摇床培养至对数生长期，取出种子液备用。将种子液在4 ℃、4 000 r/min,离心10 min，利用无菌水清洗菌体2次，最终悬浮菌体至1×107CFU/mL，备用。

1.2.5 不同NaCl含量对SP-3降解菲的影响

按照无机盐培养基体积的2%接种量接菌，将菌体分别接种到NaCl质量分数为1%、2%、3%、4%的改良无机盐培养基中，以没有接菌的无机盐培养基作为对照，每组处理重复3次。样品30 ℃，160 r/min恒温摇床培养一周，用液相色谱检测菲的含量。

1.2.6 不同培养基对菌株SP-3降解菲的影响

培养基的配制：无机盐培养基、LB培养基、改良无机盐培养基、改良LB培养基同上。按照培养基体积的2%接种量接菌，以没有接菌的培养基作为对照，每个处理重复3次，将样品30 ℃，160 r/min恒温摇床培养一周，用液相色谱检测菲的含量。

1.2.7 不同浓度的金属离子对菌株SP-3降解菲的影响

实验采用Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+4种微量元素，各元素浓度见表1。按不同比例将微量元素添加到无机盐培养基中，按照培养基体积的2%接种量接菌，以不接菌的培养基作为对照，每个处理重复3次，30 ℃摇床培养一周，利用液相色谱检测菲的含量。

表1 微量元素浓度(单位：μmol/L)

2 结果与分析

2.1 NaCl含量对菲降解的影响

分枝杆菌SP-3在不同NaCl含量下对菲的降解率见图1。结果显示，不同含量的NaCl对菲降解的影响不同，在质量分数为1%的NaCl中菌株SP-3对菲的降解效果较好，降解率达到了87.41%，随着NaCl含量的提高，菌株SP-3对菲的降解能力不断地降低，这表明NaCl对菌株的降解率有着较为明显的影响，随着NaCl浓度的提高，其对菲的降解效果受到一定程度的抑制。

2.2 不同培养基对菲降解率的影响

分枝杆菌SP-3在不同培养基中对菲的降解能力如图2所示。结果表明，分枝杆菌SP-3在LB液体培养基、改良LB液体培养基和改良的无机盐液体培养基中对菲的降解率都达到了80%以上，三者之间无显著性差异。在无机盐培养基中的降解率最小，只有43.70%。上述结果表明额外的营养物质，例如蛋白胨、酵母抽提物等对菌株的降解能力有较好的促进作用。

图1 NaCl质量分数对菌株 SP-3 降解菲的影响 Fig.1 Impact of different NaCl concentrations on phena-nthrened egradation of strain SP-3

图2 不同培养基对菌株SP-3降解菲的影响 Fig.2 Impact of different media on phenanthrene degradation of strain SP-3

2.3 不同浓度的微量元素对菲降解的影响

2.3.1 不同浓度Cu2+对菲降解率的影响

图3显示不同浓度Cu2+对分枝杆菌SP-3降解菲的影响不同，在不添加Cu2+和Cu2+浓度为0.10 μmol/L时，分枝杆菌SP-3的降解率分别是48.56%和47.85%，二者之间0.05水平上差异不显著。随着Cu2+浓度的提高，菌株SP-3对菲的降解率降低，对菌株的降解能力产生了抑制作用，在Cu2+浓度为5 μmol/L时，降解率只有9.54%。推测Cu2+含量的增加影响了菌株的生长，继而影响到菌株对菲的降解能力。

2.3.2 不同浓度Fe2+对菲降解率的影响

不同浓度Fe2+对菲降解率的影响见图4，结果显示不同浓度的Fe2+对菲降解的影响略有差异，浓度在100～250 μmol/L 之间可以提高菌株SP-3对菲的降解能力，因此在培养基中可以添加少量的Fe2+。

图3 不同浓度Cu2+对分枝杆菌SP-3降解菲的影响Fig.3 Impact of different Cu2+concentrations on phenanthrene degradation of Mycobacterium SP-3

图4 不同浓度Fe2+对分枝杆菌SP-3降解菲的影响Fig.4 Impact of different Fe2+concentrations on phenanthrene degradation of Mycobacterium SP-3

2.3.3 不同浓度Mg2+对菲降解率的影响

不同浓度Mg2+对菲降解率的影响如图5所示，从图中可以看出，Mg2+对菲的降解影响较大，在浓度为100～500 μmol/L时，菌株对菲的降解率均在60%以上，尤其是浓度为100 μmol/L时，降解率为66.83%，可见少量添加Mg2+可以提高菌株对菲的降解能力。

2.3.4 不同浓度Zn2+对菲降解率的影响

如图6所示，Zn2+浓度在0.1～2.5 μmol/L之间时，菌株对菲的降解效果不明显，当Zn2+浓度为5 μmol/L时，菲降解率达到了52.15%，说明添加少量的Zn2+可以促进菌株对菲的降解率。

图5 不同浓度Mg2+对分枝杆菌SP-3降解菲的影响 Fig.5 Impact of different Mg2+concentrations on phenan-threne degradation of Mycobacterium SP-3

图6 不同浓度Zn2+对分枝杆菌SP-3降解菲的影响 Fig.6 Impact of different Zn2+concentrations on phenanthrene degradation of Mycobacterium SP-3

3 讨论

菲作为一种典型的PAHs，在环境中分布广泛，利用微生物将其转化成为无害物质的生物修复技术受到广泛关注。目前有关环境因素对菲降解影响的研究，主要集中在碳氮源、温度、pH等方面，而菲降解过程中影响因素有很多，各个因素的影响程度不同，其中许多的机理和过程尚未完全明确。

本实验室从石油污染土壤中分离获得一株革兰氏阳性细菌SP-3，对其摇瓶发酵培养基和发酵条件进行了初步研究，本文在上述基础上，对该菌进行了NaCl含量、菲降解用培养基及不同微量元素方面的研究。研究发现，菌株SP-3在NaCl质量分数为1%时，降解率可达到87.41%，随着NaCl含量的提高，其本身对菲的降解能力不断地降低，这表明NaCl对菌株的降解率有着较为明显的影响，盐度升高会抑制菌株的生长速率和菌株对菲的降解速率，其原因是NaCl含量增加，导致菌株内部溶液浓度低于外界，致使菌体内水分大量流失引起生物体内的化学反应环境发生变化，最终抑制菌体生命活性，导致非嗜盐微生物的修复效率明显降低，修复能力丧失。通过不同培养基对菲降解率的影响，发现额外添加少量营养物质可以提高菌株对菲的降解能力，这主要是因为额外的营养物质可以在最初接菌后，较快地促进菌株的繁殖速度，提高菌株数量，使其不断地与周围环境快速地进行物质交换。

菌株在菲降解过程中，除了受到盐和营养物质的影响外，不同微量元素对菲的降解也有明显的影响。例如，Fe2+是微生物生长代谢所必需的营养物质，在菌体的生长过程中主要参与一些氧化还原反应，是电子传递链的组成部分，因此培养基中添加少量 Fe2+可以提高菌株对菲的降解能力。微生物生长代谢过程中，还受到Zn2+、Mg2+、Cu2+等各种离子的影响，例如，菌体内部的各类生化反应，需要Zn2+、Mg2+、Cu2+等的参与，本研究中发现少量添加上述离子可以提高菌株对菲的降解能力，例如，Cu2+浓度为0.10 μmol/L时，分枝杆菌SP-3的降解率为47.85%。但过量金属离子会抑制菌株的生长，甚至产生毒害作用，本文中发现随着Cu2+浓度的提高，影响了菌株的生长，继而抑制到菌株对菲的降解能力。通过上述对不同NaCl含量、培养基和微量元素中降解菲的效果研究，为今后开发利用分枝杆菌SP-3提供了可靠的理论依据。

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Impact of different salinity, culture media and trace elements on phenanthrene degradation ofMycobacteriumsp. SP-3

HUANG Yu-jie1, ZHANG Wen1, FU Xiao-wen1, GAO Yong-chao1, KONG Xue1, GUO Shu-hai1, 2, WANG Jia-ning1*

( 1. Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Ecology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China;2. Applied Ecology Institute, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China)

∶We addressed degradation effect of phenanthrene byMycobacteriumsp. SP-3 for different salinity, culture media and trace elements. Results show that degradation rate of phenanthrene is maximum, 87.41%, when salt concentration is 1%. Degradation rate of phenanthrene is more than 80% in LB liquid media, modified LB and modified inorganic salt liquid media, no significant difference among them. Fe2+concentration of 100 μmol/L, Zn2+concentration of 5 μmol/L and Mg2+concentration of 100 μmol/L can increase degradation ability ofMycobacteriumsp. SP-3 to phenanthrene. However, Cu2+can inhibit degradation ability of the strain to phenanthrene with the increase of its concentration. The results will be benefit for the application of the strain to biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and the increase of its biodegradation capability to polycyclic aromatic hydrocarbons such as phenanthrene.

∶phenanthrene; trace elements; culture medium; degradation rate;Mycobacteriumsp.

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.06.016

2016-03-22

山东省科学院先导科技专项(2013)；国家高技术研究发展计划(863计划)(2013AA06A210)；泰山学者工程专项经费资助；山东省自然科学基金(BS2015HZ011)

黄玉杰(1977—)，女，副研究员，研究方向为污染土壤生物修复。

*通信作者。E-mail:wangjn@sdas.org

X172

A

1002-4026(2016)06-098-06