大肠腺癌组织中CXCL14、EGFR的表达变化及其意义

窦欢欢，何滔，时丽芳，郑淑芳

(1天津中医药大学研究生院，天津 300193；2武警后勤学院附属医院)

大肠腺癌组织中CXCL14、EGFR的表达变化及其意义

窦欢欢1，何滔2，时丽芳2，郑淑芳2

(1天津中医药大学研究生院，天津 300193；2武警后勤学院附属医院)

目的 观察大肠腺癌组织中趋化因子14(CXCL14)和表皮生长因子受体(EGFR)的表达变化，并探讨其意义。方法 大肠腺癌患者92例，手术治疗中均留取肿瘤组织，其中53例同时留取距离肿瘤组织5 cm以外的自体非肿瘤性大肠黏膜组织，另收集21例大肠腺瘤患者手术切除的肿瘤组织。采用免疫组化SP法检测受检组织中的CXCL14和EGFR，分析CXCL14、EGFR的表达与大肠腺癌临床病理参数的关系。结果 大肠腺癌、大肠腺瘤及非肿瘤性大肠黏膜组织中CXCL14阳性率分别为79.3%(73/92)、66.7%(14/21)、56.6%(30/53)， EGFR阳性率分别为47.8%(44/92)、42.9%(9/21)、26.4%(14/53)；大肠腺癌组织中CXCL14、EGFR的表达与大肠腺瘤及非肿瘤性大肠黏膜组织相比，P均<0.05；大肠腺瘤组织中CXCL14与EGFR的表达与非肿瘤性大肠黏膜组织相比，P均>0.05。大肠腺癌组织中CXCL14和EGFR的表达与大肠腺癌的分化程度、Dukes分期有关(P均<0.05)，EGFR的表达与大肠腺癌的淋巴结转移有关(P<0.05)。CXCL14与EGFR在大肠腺癌组织中的表达呈正相关(rs=0.220，P<0.05)。结论 CXCL14、EGFR在大肠腺癌组织中高表达，可能与大肠腺癌的发生、发展有关。

大肠肿瘤；大肠癌；大肠腺癌；趋化因子14；表皮生长因子受体

大肠腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，常规治疗手段是手术、化疗、综合治疗，病死率居恶性肿瘤第5位。近年来，随着肿瘤个体化治疗和靶向治疗技术的进展，探讨大肠腺癌发生的分子机制，寻找可能的治疗靶点，对改善大肠腺癌的疗效具有重要意义。趋化因子14(CXCL14)是新近发现的趋化因子家族成员之一，其在头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中的表达已有研究，但结果并不一致[1～3]，其在大肠腺癌中的研究报道很少。

表皮生长因子受体(EGFR)在许多恶性肿瘤异常增殖信号通路中起调节作用[4]。本研究观察了大肠腺癌组织中CXCL14和EGFR的表达变化，分析二者与大肠腺癌临床病理特征之间的关系及二者的相关性，以探讨大肠腺癌发生的分子机制，寻找可能的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2014年6月～2015年11月收治的大肠腺癌患者92例(中高分化腺癌59例，低分化腺癌33例)，男60例，女32例；年龄31～83岁；术前未接受放疗和化疗；手术治疗中均留取肿瘤组织(浸润至浆膜层、肌层74例，浸润至黏膜层、黏膜下层18例)，其中53例同时留取距离肿瘤组织5 cm以外的自体非肿瘤性大肠黏膜组织。另收集21例大肠腺瘤患者手术切除的肿瘤组织。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 CXCL14、EGFR检测方法 CXCL14兔抗人多克隆抗体(浓缩型)购自美国ProteintechTM公司；EGFR鼠抗人单克隆抗体(浓缩型)购自美国Origene公司；辣根过氧化物酶标记通用型Ⅱ抗、羊血清封闭液、DAB购自福州迈新生物技术有限公司。所有组织标本经10%甲醛缓冲溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片5张；其中1张行HE染色，经2名高年资病理医生复检，明确其病理诊断、组织学分级、浸润深度及淋巴结转移等情况；其余4张黏附于经APES胶处理的免疫切片备做免疫组化染色。采用免疫组化SP法检测CXCL14及EGFR，CXCL14抗体稀释比例为1∶400，EGFR抗体稀释比例为1∶200，以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，以试剂盒附带的阳性切片作阳性对照，所有受检切片同批次染色。CXCL14、EGFR均呈黄色细颗粒状，前者定位于胞质，后者定位于胞膜和胞质。首先于低倍镜下观察标本切片整体，找出肿瘤区域，然后按照白细胞计数原则(避开大血管、大片间质与大片坏死区)于肿瘤区域随机选取10个高倍(400×)视野，分别按照细胞着色强度和着色细胞百分比计分[5]：细胞无着色计0分、淡黄色计1分、棕黄色计2分、棕褐色计3分；阳性细胞<5%计0分、5%～ 25%计 1分、 26%～50%计2分、>50%计3分；上述两项分值的乘积≤3为阴性、>3为阳性[4]。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料比较用χ2检验，相关性分析用Spearman相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCL14和EGFR在大肠腺癌、大肠腺瘤及非肿瘤性肠黏膜组织中的表达比较 大肠腺癌、大肠腺瘤及非肿瘤性大肠黏膜组织中CXCL14阳性率分别为79.3%(73/92)、66.7%(14/21)、56.6%(30/53)， EGFR阳性率分别为47.8%(44/92)、42.9%(9/21)、26.4%(14/53)；大肠腺癌组织中CXCL14、EGFR的表达与大肠腺瘤组织及非肿瘤性大肠黏膜组织相比，P均<0.05；大肠腺瘤组织中CXCL14与EGFR的表达与非肿瘤性大肠黏膜组织相比，P均>0.05。

2.2 CXCL14和EGFR表达与大肠腺癌临床病理参数的关系 CXCL14和EGFR的表达与大肠腺癌的组织分化程度、Dukes分期有关(P均<0.05)，EGFR的表达与大肠腺癌淋巴结转移有关(P<0.05)；CXCL14、EGFR表达与大肠腺癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、浸润深度无关(P均>0.05)，CXCL14表达与大肠腺癌淋巴结转移无关(P>0.05)。详见表1。

表1 CXCL14、EGFR表达与大肠腺癌

2.3 大肠腺癌组织中CXCL14、EGFR表达的相关性 大肠腺癌组织中CXCL14与EGFR均阳性者39例、均阴性者14例，二者表达呈正相关关系(rs=0.220，P<0.05)。

3 讨论

CXCL14最早从乳腺和肾脏组织中提取得到，定位于人染色体5q31.1，由77个氨基酸组成，具有激活巨噬细胞、未成熟树突状细胞和自然杀伤细胞的能力，其特异性受体目前尚未发现[6]。CXCL14受体和信号转导通路与其他常见的趋化因子家族成员不同[7]。目前，“正常黏膜→腺瘤→癌演变”学说已是较为公认的大肠腺癌发生学说，大肠腺瘤是典型的大肠腺癌癌前病变之一。本研究结果显示，CXCL14在大肠腺癌中的阳性表达率高于大肠腺瘤和非肿瘤性大肠黏膜，提示CXCL14高表达与大肠腺癌的发生有关。另外，本研究发现低分化大肠腺癌CXCL14阳性表达率高于中高分化大肠腺癌，Dukes分期C～D期大肠腺癌的CXCL14阳性表达率高于A～B期，提示CXCL14表达与大肠腺癌的发展密切相关。Kleer 等[8]研究证实，CXCL14内源性表达可以促进乳腺癌和胰腺癌细胞的生长和侵袭，作用机制可能是其通过活性氧族 (ROS)/激活蛋白-1/CXCL14通路提高细胞内钙离子浓度而调节线粒体功能和活性氧应激能力，从而促进肿瘤细胞的运动。在乳腺癌细胞内线粒体呼吸链紊乱ROS上调会导致新一代细胞亚克隆而激活细胞的增殖、运动和侵袭行为[2]。另外，CXCL14在肺癌与头颈部鳞癌中的表达是下降的，CXCL14可与趋化因子受体4(CXCR4)结合竞争性抑制趋化因子12(CXCL12)/CXCR4生物学轴功能，CXCL12/CXCR4生物学轴可为许多肿瘤细胞利用并促进其生长、血管生成和转移[9～11]。由于CXCL14的特异性受体目前尚未明确，故其具体作用机制尚不清楚。有学者[6]提出CXCL14可能因肿瘤发生部位不同而呈现不同功能。 Ikoma等[12]研究提出CXCL14在上皮细胞中的表达也会因刺激因素的不同而不同，并发现CXCL14的表达会随细胞密度的增加而上调。

EGFR是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶受体，是表皮生长因子(EGF)的受体，与肿瘤细胞的增殖、分化、肿瘤侵袭转移及细胞凋亡的抑制有关[13]。EGFR是反映细胞增殖活性的重要指标，其表达率可直接反映细胞增殖情况[14]。本研究结果显示，大肠腺癌组织EGFR阳性表达率明显高于非肿瘤大肠黏膜组织，并且与大肠腺癌分化程度、Dukes分期、淋巴结转移有关。EGFR主要通过Ras/Raf/MAPK、PI3K/Akt两条通路传递信号到胞核，调节细胞的增殖、分化，同时EGFR表达上调[15]。EGFR对肿瘤的生长、发展和肿瘤干细胞特性的维持具有重要作用，并在多种肿瘤细胞中存在过表达现象，EGFR通路是肿瘤治疗的一个重要靶点[16]。本研究结果显示，大肠腺癌组织中CXCL14与EGFR的表达呈正相关，提示EGFR和 CXCL14在大肠癌的发生、发展和转移过程中起协同作用，但二者协同作用的机制有待进一步探讨。

[1] Williams KA, Lee M, Hu Y, et al. A systems genetics approach identifies CXCL14, ITGAX, and LPCAT2 as novel aggressive prostate cancer susceptibility genes[J].PLoS Genet, 2014,10(11):1004809.

[2] Pelicano H, Lu W, Zhou Y, et al. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species imbalance promote breast cancer cell motility through a CXCL14-mediated mechanism[J].Cancer Res, 2009,69(6):2375-2383.

[3] Maehata Y, Ozawa S, Kobayashi K, et al. Reactive oxygen species (ROS) reduce the expression of BRAK/CXCL14 in human head and neck squamous cell carcinoma cells[J].Free Radic Res, 2010,44(8):913-924.

[4] 祁秀敏, 张熔熔, 吕慧. EGFR及耐药表型GST-π、P-gp、TopoⅡ在大肠癌组织中的表达及意义[J]. 山东医药, 2014,54(10):88-90.

[5] 邢传平,刘斌，董亮. 免疫组织化学标记结果的判断方法[J].中华病理学杂志,2001,30(4):77.

[6] Benarafa C, Wolf M. CXCL14: the Swiss army knife chemokine[J].Oncotarget, 2015，6(33)：34065-34066.

[7] Hara T, Tanegashima K. Pleiotropic functions of the CXC-type chemokine CXCL14 in mammals[J].J Biochem, 2012,151(5):469-476.

[8] Kleer CG, Bloushtain-Qimron N, Chen YH, et al. Epithelial and stromal cathepsin K and CXCL14 expression in breast tumor progression[J]. Clin Cancer Res, 2008,14(17):5357-5367.

[9] Tanegashima K, Suzuki K, Nakayama Y, et al. CXCL14 is a natural inhibitor of the CXCL12-CXCR4 signaling axis[J].FEBS Lett, 2013,587(12):1731-1735.

[10] Otte M, Kliewer A, Schutz D, et al. CXCL14 is no direct modulator of CXCR4[J].FEBS Lett,2014,588(24):4769-4775.

[11] 郑淑芳, 展晓红, 时丽芳, 等. 大肠癌中SDF-1与CXCR4的表达及临床意义[J]. 临床与实验病理学杂志, 2013,29(1):9-13.

[12] Ikoma T, Ozawa S, Suzuki K, et al. Calcium-calmodulin signaling induced by epithelial cell differentiation upregulates BRAK/CXCL14 expression via the binding of SP1 to the BRAK promoter region[J].Biochem Biophys Res Commun, 2012,420(2):217-222.

[13] 张爱丽，孙蕾娜，张丹丹，等.原发性肺癌组织中COX-2、EGFR、PDGFR和nm23的表达变化及意义[J]. 山东医药，2015，55(37)：57-59.

[14]魏晓莹，孙新臣，曹远东，等.EGFR和VEGT在大肠癌组织中的表达及临床意义[J]. 临床肿瘤学杂志，2009，14(10)：895-899.

[15] Hendifar A, Tan CR, Annamalai A, et al. Biomarker-driven EGFR therapy improves outcomes in patients with metastatic colorectal cancer[J].Expert Rev Anticancer Ther, 2014,14(9):1051-1061.

[16] 祁秀敏，张熔熔，吕慧.EGFR及耐药表型GST-π、P-gp、TopoⅡ在大肠癌组织中的表达及意义[J].山东医药，2014,54(10):88-90.

天津市应用基础及前沿技术研究计划面上项目(11JCYBJC13000)。

郑淑芳(E-mail: zhengshf@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.030

R735.3

B

1002-266X(2016)43-0090-03

2016-07-27)