大剂量糖皮质激素应用过程中早期给予ACTH大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能及病理变化

杨丽潇，张碧丽，王文红

(1天津医科大学研究生院，天津300070；2天津市儿童医院)

大剂量糖皮质激素应用过程中早期给予ACTH大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能及病理变化

杨丽潇1，张碧丽2，王文红2

(1天津医科大学研究生院，天津300070；2天津市儿童医院)

目的 观察大剂量糖皮质激素(GC)应用过程中早期给予促肾上腺皮质激素(ACTH)大鼠下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的功能及病理变化。方法 将30只健康雄性Wistar大鼠随机分为正常组、对照组和治疗组，每组10只。正常组予蒸馏水灌胃2周，对照组和治疗组用大剂量醋酸泼尼松水溶液灌胃2周；之后治疗组加用ACTH皮下注射2周，其余两组灌胃方法不变。分别于实验开始时、实验满2周时、实验满4周时测定大鼠血清皮质醇及ACTH；实验满4周时处死各组大鼠，测大鼠垂体、肾上腺质量并观察其病理形态，计算大鼠脏器指数。结果 实验开始时各组大鼠血清皮质醇及ACTH水平相近(P均>0.05)。实验满2周时，对照组和治疗组大鼠血清皮质醇及ACTH水平相近(P均>0.05)。实验满4周时，治疗组大鼠血清皮质醇和ACTH水平较对照组升高(P均<0.05)，且垂体和肾上腺的质量及其脏器指数也较对照组升高(P均<0.05)。实验满4周时，各组大鼠垂体远侧部未见明显改变；正常组大鼠肾上腺皮质束状带结构清晰，对照组较正常组束状带变薄且结构紊乱；治疗组与对照组相比束状带增厚、细胞核增多，但较正常组结构排列紊乱。结论 大剂量GC应用过程中早期给予ACTH可减轻GC对大鼠HPA轴的抑制作用，促进其皮质醇和ACTH的分泌，促进其垂体和肾上腺的增生，并能明显改善其肾上腺皮质的萎缩情况。

促肾上腺皮质激素；糖皮质激素；下丘脑-垂体-肾上腺轴；原发性肾病综合征；动物实验

儿童原发性肾病综合征(PNS)的主要治疗药物是糖皮质激素(GC)，尤其是频繁复发和激素依赖的PNS需要通过延长GC疗程或加用细胞毒药物、免疫抑制剂治疗，导致不良反应严重[1，2]。患儿长期使用大剂量外源性GC，可出现下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴抑制，这是PNS出现频繁复发和激素依赖的重要机制之一[3]。新近研究[4]发现，根据血清皮质醇、促肾上腺皮质激素(ACTH)水平可以在一定程度上预测激素敏感型PNS的复发风险。ACTH是由脑垂体分泌的一种多肽类激素，有类糖皮质激素样作用，在皮质功能尚存时可刺激肾上腺皮质分泌皮质醇，对HPA轴功能有一定的调节作用。我们推测，早期补充外源性ACTH，有望减轻大剂量GC对大鼠HPA轴的抑制作用，减少不良反应的发生。2016年4月1日～6月1日，我们通过实验观察了大剂量GC应用过程中早期给予ACTH大鼠HPA轴的功能及病理变化。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物、动物及试剂 醋酸泼尼松片(5 mg/片)，ACTH1-39(10 mg/支)。健康雄性Wistar大鼠30只，SPF级，日龄(40±5)d。皮质醇检测试剂盒，ACTH检测试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组 30只雄性Wistar大鼠适应性喂养3 d，按照随机数字表法将其随机分为正常组、对照组和治疗组，每组10只。

1.2.2 药物配制及给药方法 实验开始时，正常组大鼠每日1次予4 mL/kg蒸馏水灌胃2周；对照组、治疗组每日1次予大剂量(12.5 mg/kg，相当于儿童2 mg/kg)醋酸泼尼松水溶液灌胃，共2周[5]。实验第3周起，正常组灌胃方法同前；对照组继续每日1次予大剂量醋酸泼尼松水溶液灌胃2周；治疗组在大剂醋酸泼尼松水溶液灌胃后每日1次皮下注射ACTH 200 μg/kg，共2周。本实验共4周，清晨8时前灌胃、皮下注射完毕。实验期间，每3 d称大鼠体质量1次，以调整药物用量。实验过程中大鼠自由进食及饮水，观察各组大鼠的生长发育、外观、反应性、活动性、食欲、摄食量及体质量变化。

1.2.3 各组大鼠血清皮质醇及ACTH测定 分别于实验开始时、实验满2周时、实验满4周时，在醋酸泼尼松水溶液灌胃前，于大鼠内眦取血约2 mL，高速离心后，测定血清皮质醇及ACTH。

1.2.4 各组大鼠垂体、肾上腺质量检测及病理形态观察 实验满4周时，将各组大鼠称重后断头处死，迅速摘取其垂体和双侧肾上腺(去除肾上腺被膜周围的脂肪及结缔组织)，称重后将其固定于10%甲醛溶液中，切片、HE染色后观察病理形态。同时计算大鼠脏器指数(脏器质量/大鼠体质量)。

2 结果

实验开始时，各组大鼠生长发育良好，皮毛光亮，反应灵敏，活动灵活。实验过程中，正常组大鼠生长发育较快，皮毛有光泽，反应灵敏，活动敏捷，体质量增长稳定；对照组大鼠生长发育较差，毛发无光泽、蓬乱、容易脱落，反应迟钝，腰腹部肥胖，四肢消瘦明显；治疗组大鼠生长发育尚可，毛发稍有光泽，反应稍迟钝，体质量增长缓慢。各组大鼠均无感染、死亡。

2.1 各组大鼠血清皮质醇及ACTH水平比较 实验过程中不同时间点各组大鼠血清皮质醇及ACTH水平比较见表1。

2.2 各组大鼠体质量、垂体和肾上腺质量、脏器指数比较 实验满4周时各组大鼠体质量、垂体和肾上腺质量、脏器指数比较见表2。

2.3 各组大鼠肾上腺和垂体的病理变化 实验满4周时，各组大鼠垂体远侧部未见明显改变。实验满4周时，正常组大鼠肾上腺皮质球状带、束状带、网状带及髓质结构显示清楚，排列整齐(图1A)；对照组肾上腺皮质束状带萎缩明显，结构紊乱消失、轮廓模糊不清(图1B)；治疗组肾上腺皮质束状带与对照组相比有不同程度的增生，可见该区细胞核增多明显，但结构较正常组紊乱(图1C)。

表1 不同时间点各组大鼠血清皮质醇、ACTH水平比较

注：与正常组相比，aP<0.05；与对照组相比，bP<0.05；与实验开始时相比，cP<0.05；与实验满2周时相比，dP<0.05。

表2 实验满4周时各组大鼠体质量、垂体及肾上腺质量和脏器指数比较( x±s)

注：与正常组相比，aP<0.05；与对照组相比，bP<0.05。

注：A为正常组，B为对照组，C为治疗组。

图1 大鼠肾上腺病理图像(HE染色)

3 讨论

目前GC仍然是PNS的一线治疗药物，但是长期大剂量使用GC出现的一系列不良反应[6]引起了学者们的重视，尤其是GC对患儿HPA轴抑制的研究日渐增多。国内研究[7]发现，不同中效GC对非频繁复发PNS患儿血清皮质醇水平有影响，其中泼尼松对垂体功能的抑制作用较曲安西龙及甲泼尼龙持久。临床上ACTH已用于慢性湿疹[8]、婴儿痉挛[9～11]、晶状体性关节炎[12]等疾病的治疗，并有很好的疗效，且比较安全。近年ACTH在治疗肾病中的研究也较多，如在特发性膜性肾小球肾炎[13]、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)[14]和免疫抑制剂治疗失败的难治性肾病[15]及其他肾小球疾病[16]中的应用呈现了一定的治疗效果。因此，ACTH减轻GC对HPA轴的抑制作用，为临床PNS患儿GC应用中减少频繁复发和激素依赖的发生率是有意义的。

文献[17,18]报道非频繁复发PNS患儿在GC诱导缓解期即大剂量GC持续应用的过程中，血清皮质醇水平下降明显，对HPA轴有明显的抑制作用，这是PNS患儿出现频繁复发和激素依赖的重要原因之一。在本研究中，实验满2周时，与正常组相比，对照组和治疗组大鼠的血清皮质醇及ACTH水平明显降低，且与同组实验开始时相比亦明显降低，表明大剂量的醋酸泼尼松应用早期对大鼠HPA轴就有明显的抑制作用。实验满4周时，即ACTH治疗2周后，治疗组大鼠的血清皮质醇及ACTH水平明显高于对照组，且较治疗前升高明显；治疗组大鼠的垂体、肾上腺质量及脏器指数与对照组相比升高亦有统计学意义；病理检查结果显示，与对照组相比，治疗组大鼠肾上腺皮质束状带增生明显。ACTH治疗过程中无明显不良反应。上述结果表明ACTH应用2周即可明显促进大鼠内源性皮质醇和ACTH的分泌，在一定程度上促进垂体和肾上腺的增生，并且能够改善肾上腺皮质束状带的萎缩情况。研究[19]发现，PNS频繁复发及激素依赖患儿应用ACTH有一定疗效，可避免长期GC治疗的不良反应，其机制可能与ACTH减轻GC对HPA轴的抑制作用有关。因此，临床上在应用大剂量GC治疗PNS早期即给予ACTH，可能会降低PNS患儿频复发和激素依赖的发生率。

本研究对大鼠垂体的病理观察不是很理想，这可能与实验的周期较短，垂体病理改变不显著有关。另外，实验结束时治疗组大鼠的体质量与对照组相比增长不明显，这可能与ACTH减轻大剂量GC的不良反应、抑制脂肪的合成和重新分布有关。

总之，本研究从功能和形态两方面进行观察，发现大剂量GC应用过程中早期给予ACTH能够促进大鼠垂体及肾上腺皮质束状带的增生和分泌，减轻大剂量GC对大鼠HPA轴的抑制作用。今后可进一步以PNS患儿作为观察对象进行相关研究。

[1] Lombel RM, Gipson DS, Hodson EM. Treatment of steroid-sensitive nephrotic syndrome: new guidelines from KDIGO[J]. Pediatr Nephrol, 2013,28(3):415-426.

[2] 全国儿童常见肾脏病诊治现状调研工作组.我国儿童激素敏感、复发/依赖肾病综合征诊疗现状的多中心研究[J].中华儿科杂志，2014，52(3)：194-200.

[3] Reddy S, Ananthakrishnan S, Garq A. A prospective observational study evaluating hypothalamic-pituitary-adrenal axis alteration and efficacy of intramuscular triamcinolone acetonide for steroid-responsive dermatologic disease[J]. J Am Acad Dermatol, 2013, 69(2):226-231.

[4] 张建江，王娜，王淼，等.激素敏感型肾病综合征患儿血清皮质醇和促皮质素水平变化的意义[J].中华实用儿科临床杂志，2015,30(5):351-354.

[5] 文琼仙,陈延强,叶琳,等.肾康2号对HPA轴抑制模型大鼠的HPA轴影响的实验研究[J].中国实用护理杂志,2009,25(34):12-13.

[6] 钟伟恩,叶红,李石红,等.长期应用糖皮质激素的肾病综合征患儿胰岛素抵抗的影响因素及干预[J].山东医药,2014,54(13):49-50.

[7] 王文红，张碧丽，刘竹枫，等.不同中效糖皮质激素对非频复发肾病血清皮质醇及ACTH的影响[J].天津医药，2013,41(3):212-215.

[8] 夏乐印.促肾上腺皮质激素(ACTH)治疗慢性湿疹的临床分析[J].当代医学,2014,20(16):135-135.

[9] 王治静，汪东，李霞.不同小剂量促皮质素治疗婴儿痉挛症疗效评估及随访研究[J].中华实用儿科临床杂志，2014,29(21):1661-1664.

[10] Jaseja H, Jaseja B, Badaya S, et al. Superior therapeutic efficacy of adrenocorticotrophic hormone(ACTH)in infantile spasms: emerging evidence[J]. Epilepsy Behav, 2012,25(2):250-250.

[11] Fukui M, Shimakawa S, Tanabe T, et al. Partial seizures during ACTH therapy in a cryptogenic west syndrome patient[J]. Brain Dev, 2014,36(1):80-83.

[12] Daoussis D, Ioannis A, Andonopoulos AP. ACTH as a treatment for acute crystal-induced arthritis: update on clinical evidence and mechanisms of action[J]. Semin Arthritis Rheum, 2014,43(5):648-453.

[13] Gigante A， Rosato E, Liberatori M, et al. ACTH and azathioprine: antiproteinuric and lipid-lowering effect in the course of idiopathic membranous glomerulonephritis[J]. J Biol Regul Homeost Agents, 2012,26(1):135-138.

[14] Hogan J， Bomback AS, Mehta K, et al. Treatment of idiopathic FSGS with adrenocorticotropic hormone gel[J]. Clin J Am Soc Nephrol, 2013,8(12):2072-2081.

[15] Lorusso P, Bottai A, Mangione E, et al. Low-dose synthetic adrenocorticotropic hormone-analog therapy for nephrotic patients:results from a single-center pilot study[J]. Int J Nephrol Renovasc Dis, 2015,5(8):7-12.

[16] Bomback AS, Canetta PA, Beck LH, et al. Treatment of resistant glomerular diseases with adrenocorticotropic hormone gel: a prospective trial[J]. Am J Nephrol， 2012,36(1):58-67.

[17] Valentina V, Silvia G, Eleonora R, et al. Cross-talk between adipose tissue and the HPA axis in obesity and overt hypercortisolemic states[J]. Horm Mol Biol Clin Investig, 2014,17(2):63-77.

[18] Nynke T, Holthe KV, Nienske VR, et al. Extending prednisolone treatment does not reduce relapses in childhood nephrotic syndrome[J]. J Am Soc Nephrol, 2013,24(1):149-159.

[19] 黄建萍，赵晓艳，都娟，等.促肾上腺皮质激素应用于原发性肾病综合征频复发及激素依赖患儿疗效及安全性初探[J].中国循证儿科杂志，2012，7(3):178-181.

Functional and pathological changes of HPA axis of rats in the early-stage application of ACTH during the process of using a large dose of glucocorticoid

YANGLixiao1,ZHANGBili,WANGWenhong

(1GraduateSchoolofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Objective To observe the functional and pathological changes of hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis of rats in the early-stage application of adrenocorticotropic hormone (ACTH) during the process of using a large dose of glucocorticoid (GC).Methods Thirty male Wistar rats were randomly divided into the normal group, control group and ACTH treatment group, 10 rats in each group. Rats of the normal group were given distilled water by gavage for 2 weeks. Rats of the control group and ACTH treatment group were treated with high dose of prednisone acetate in aqueous solution by gavage for 2 weeks. After that, the ACTH treatment group was treated with subcutaneous injection of ACTH for 2 weeks, and the other two groups were treated with the same treatment as before. The levels of cortisol and ACTH in serum were measured respectively at the beginning of the experiment, at the end of 2 and 4 weeks after the experiment. When the experiment was over 4 weeks, the rats were killed, the quality of the pituitary and adrenal glands were measured, the pathological changes were observed, and organ index was calculated.Results At the beginning of the experiment, there was no difference in the serum cortisol and ACTH between the groups (P>0.05). At the end of 2 weeks after the experiment, there was no significant difference in serum cortisol and ACTH between the control group and the ACTH treatment group (P>0.05). At the end of 4 weeks after the experiment, the serum cortisol and ACTH levels in the ACTH treatment group were higher than those in the control group (allP<0.05), and the quality of pituitary, adrenal gland and organ index were higher than those of the control group (allP<0.05). At the end of 4 weeks after the experiment, no significant changes were found in the distal part of the pituitary of rats in each group. And the structure of adrenal cortex zona of rats in the normal group was clear. The structure of adrenal cortex zona of the control group was thinning and disordered as compared with that of the normal group. The structure of adrenal cortex zona of the ACTH treatment group was thickening and the nucleus increased at different degrees as compared with that of the control group, but it arranged in disorder as compared with that of the normal group.Conclusion Early application of ACTH in the process of using high dose GC can reduce the inhibitory effect of GC on HPA axis in rats, accelerate the adrenal cortex zona secretion, promote the proliferation of pituitary and adrenal gland, and improve the adrenal cortex zona atrophy in pathology significantly.

adrenocorticotropic hormone; glucocorticoid; hypothalamic-pituitary-adrenal axis; primary nephrotic syndrom; animal experiment

天津市中医药管理局中医、中西医结合科研专项基金资助项目(13127)。

杨丽潇(1988-)，女，硕士研究生在读，主要研究方向为儿科学。E-mail： 15369313972@163.com

简介：张碧丽(1959-)，女，主任医师，主要研究方向为小儿肾脏疾病。Email： zhangbili218@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.007

R725

A

1002-266X(2016)43-0022-04

2016-05-14)