玫烟色棒束孢侵染对烟粉虱成虫体内不同酶活的影响

田 晶，刁红亮，马瑞燕

（1.吕梁学院生命科学系，山西离石033000；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801）

玫烟色棒束孢侵染对烟粉虱成虫体内不同酶活的影响

田 晶1，2，刁红亮2，马瑞燕2

（1.吕梁学院生命科学系，山西离石033000；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801）

对玫烟色棒束孢侵染烟粉虱成虫后其体内的保护酶（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT））和解毒酶（谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE））的活力进行测定。结果表明，玫烟色棒束孢侵染烟粉虱成虫后，烟粉虱成虫体内SOD，POD，CAT，GSTs和CarE活力都受到明显影响；SOD，POD，CAT，GSTs和CarE活力在感病前期均有上升趋势，且高于对照，在接菌48～60 h时酶活力达到最大，然后酶活力开始下降，至84 h时均显著低于对照。可见，玫烟色棒束孢的侵染严重影响了烟粉虱正常的生理活动。

玫烟色棒束孢；烟粉虱成虫；保护酶；解毒酶

玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）广泛分布在世界各地，因此，寄主范围也相当广泛，包括同翅目、双翅目、鞘翅目等[1]。山西农业大学生物防治研究室在田间分离到1株玫烟色棒束孢菌株，经过初步致病力测定，证明该菌对烟粉虱有较强的致病力[2]。

与大多数虫生真菌一样，玫烟色棒束孢的菌丝也要穿透寄主的体壁才能对寄主进行侵染。菌丝进入寄主血腔后，会遭到寄主防御系统的抵抗[3]。在逆境胁迫下，昆虫体内的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等多种抗氧化酶含量会发生变化，以抵御外界的侵害[4-5]。谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和羧酸酯酶（CarE）能参与许多分子的解毒机制，在保护组织抵御氧化侵害中起重要作用[6-7]。在之前的研究中，对玫烟色棒束孢侵染烟粉虱2龄若虫后其体内酶活进行了测定[8]，玫烟色棒束孢同样对烟粉虱成虫有致病作用[2]。

为了进一步了解烟粉虱成虫感染玫烟色棒束孢后体内酶的变化规律，揭示其与玫烟色棒束孢侵染的相关性，本研究对感染玫烟色棒束孢的烟粉虱成虫体内保护酶和解毒酶的活性进行了测定，为进一步研究玫烟色棒束孢对烟粉虱的侵染机制奠定理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试菌株：玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）IF-1106菌株。

供试昆虫：烟粉虱（Bemisia tabaci）。

1.2 菌液制备及试虫处理

菌液制备及成虫取样方法参照烟粉虱致病力测定方法[2]。玫烟色棒束孢孢子悬浮液浓度为1.0× 107个/mL。成虫处理12 h后开始取样，每12 h取样一次，取共7次。

1.3 酶液制备

将100头成虫置于加有1mL 0.05mol/L PBS缓冲液研钵后，冰浴匀浆。匀浆液在4℃，12 000 r/min条件下冷冻离心20min，取上清液作为酶液。

1.4 酶活测定

1.4.1 超氧化物歧化酶（SOD）活力测定 其按略改进的Beauchamp等[9]的方法测定。3mL反应体系：2.2 mL 0.05 mol/L PBS缓冲液，0.3 mL 130 mmol/L Met溶液，0.3 mL 750 μmol/L NBT溶液，0.03 mL 10 mmol/L EDTA-Na溶液，0.12 mL 100 μmol/L核黄素溶液，酶液0.05 mL。将反应液置于25℃，4 000 lx光照下反应，30 min后用黑暗终止反应，在560 nm下测定OD值，重复3次[10]。酶活性大小以单位时间单位蛋白的OD560变化值（U/mg）来表示。

1.4.2 过氧化物酶（POD）活力测定 其测定参照Simon等[11]的方法并略加改动。首先取28 μL 30%的H2O2和19 μL的愈创木酚加入50 mL 0.05 mol/L PBS缓冲液（pH＝6.0），反应时取上述混合溶液1mL与50 μL酶液混合，5 min后终止反应。470 nm下测定5min前后的OD470值，以每分钟单位蛋白OD470变化值（U/（mg·min））来表示酶活力大小。

1.4.3 过氧化氢酶（CAT）活力测定 其测定按李周直等[12]的方法略加改动。1mL反应液中含0.5mL 0.1 mol的H2O2和0.5 mL的酶液，对照以0.5 mL的PBS缓冲液代替酶液，30℃恒温水浴10 min后加入0.5 mL 10%的H2SO4终止反应，用0.1 mol的KMnO4滴定剩余的H2O2，记录消耗的KMnO4量。酶活性用每毫克蛋白在10 min内分解H2O2的量（mg）来表示。

1.4.4 谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）活力测定 其测定参照Habig[13]的方法，略有改动。3mL反应液中加入2.78 mL 0.05 mol/L PBS缓冲液，0.1 mL 0.02 mol的还原型谷胱甘肽和0.02mL 0.03mol/L的1-氯-2，4-二硝基苯和0.01 mL的酶液，在340 nm下记录2min内OD值的变化。酶活性大小以单位时间单位蛋白OD340变化值（U/（mg·min））来表示。

1.4.5 羧酸酯酶（CarE）活力测定 其测定参照Stumpf等[14]的方法，略有改动。3.2 mL反应液中加入0.05 mol/L PBS缓冲液0.45 mL，3×10-4mol/L的α-乙酸萘酯1.8 mL，0.05 mL酶液，30℃恒温水浴15 min后加入0.9 mL 1%的固蓝B盐终止反应，600 nm下测定OD值，重复3次。酶活性大小以单位时间单位蛋白OD600变化值（U/（mg·min））来表示。

1.4.6 酶液蛋白质含量测定 其参照Bradford[15]的方法，用考马斯亮蓝G-250方法测定各酶液中蛋白质的含量。

1.5 数据分析

采用成对数据t检验法分析同一时间下处理与对照间酶活，数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 玫烟色棒束孢侵染对烟粉虱成虫体内SOD活力的影响

从图1可以看出，玫烟色棒束孢接种处理的烟粉虱成虫的SOD活力呈现先升高后降低的趋势，而对照的SOD活力基本不变。接种60 h后，处理组的烟粉虱成虫SOD活力达到最高，为301.77 U/mg，与对照组间差异显著。此后，处理组SOD活力逐渐降低，至84 h时，SOD活力下降为114.90 U/mg。玫烟色棒束孢接种处理后，烟粉虱成虫SOD活力呈现出先升高后降低的趋势，说明烟粉虱成虫在感菌后，体内SOD活力迅速提高以增强抵御能力，但SOD活力达到一定值后，菌体的入侵对虫体组织器官形成了干扰，影响昆虫正常的生理活动，使其SOD分泌受到抑制，因此，酶活力开始下降。

2.2 玫烟色棒束孢侵染对烟粉虱成虫体内POD活力的影响

由图2可知，玫烟色棒束孢接种处理的烟粉虱成虫的POD活力呈现先升高后降低的趋势，而对照的POD活力基本上不变。接种48 h后，处理组的烟粉虱成虫POD活力达到最高，为14.96U/（mg·min），与对照组间差异显著。此后，处理组POD活力逐渐降低，至84 h时，POD活力下降为2.51U/（mg·min）。成虫的POD活力呈现出先升后降的趋势，说明烟粉虱成虫在受到玫烟色棒束孢的侵染后，体内的POD不断变化以适应该菌的侵染，但到了侵染后期，可能由于玫烟色棒束孢菌丝的大量繁殖或产生一些毒素，POD的合成受到影响，从而使处理组酶活低于对照。

2.3 玫烟色棒束孢侵染对烟粉虱成虫体内CAT活力的影响

从图3可以看出，玫烟色棒束孢接种处理的烟粉虱成虫的CAT活力呈现先升高后降低的趋势，而对照的CAT活力基本上不变。接种48 h后，处理组的烟粉虱成虫CAT活力达到最高，为4.87mg，与对照组间差异显著。此后，处理组CAT活力逐渐降低，至84h时，CAT活力下降为1.95mg。CAT活力呈现先升高后降低的趋势，说明在感病前期，其体内的CAT活力升高以消除毒害的影响，但在侵染后期，虫体组织和物质的代谢受到了严重的影响，虫体清除自由基的能力显著下降。

2.4 玫烟色棒束孢侵染对烟粉虱成虫体内GSTs活力的影响

从图4可以看出，玫烟色棒束孢接种处理的烟粉虱成虫的GSTs活性呈现出先升高后降低的趋势，而对照的GSTs活力基本保持不变。接种48 h后，处理组的烟粉虱成虫GSTs活力达到最高，为2.61U/（mg·min），与对照组间差异显著。此后，处理组GSTs活力逐渐降低，至84 h时，GSTs活力下降为0.56U/（mg·min）。GSTs活力呈现先升高后降低的趋势，在侵染前期，虫体内的解毒酶活力增加，以维持正常的生理活动，在侵染后期，由于虫体组织发生病变，虫体解毒能力下降。

2.5 玫烟色棒束孢侵染对烟粉虱成虫体内CarE活力的影响

从图5可以看出，玫烟色棒束孢接种处理的烟粉虱成虫的CarE活力呈现先升后降的趋势，而对照的CarE活力基本上不变。接种48 h后，处理组的烟粉虱成虫CarE活力达到最高，为0.52 U/（mg· min），与对照组间差异显著。此后，处理组CarE活力逐渐降低，至84 h时，CarE活力下降为0.11 U/（mg·min）。CarE活力呈现先升高后降低的趋势，在侵染前期，虫体内的解毒酶活力增加，以维持正常的生理活动，在侵染后期，由于虫体组织发生病变，虫体解毒能力下降。

3 结论与讨论

本研究结果表明，和烟粉虱2龄若虫一样，烟粉虱成虫的保护酶（SOD，POD，CAT）和解毒酶（GSTs，CarE）都受到玫烟色棒束孢侵染的影响。烟粉虱感染玫烟色棒束孢后，其体内SOD，POD，CAT，GSTs和CarE较正常虫体都有不同程度的变化，说明感病烟粉虱体内SOD，POD，CAT，GSTs和CarE活性变化与玫烟色棒束孢的侵染有关。

昆虫体内存在着抗氧化酶系统，在正常的条件下，SOD可以催化氧自由基变成H2O2，然后CAT和POD可将H2O2进一步催化变成H2O。通过这些反应可以消除昆虫体内的自由基。但若抗氧化酶系统遭到破坏，打破了细胞内氧自由基的平衡，便会导致生物细胞内氧自由基的浓度升高，自由基超强的氧化能力将破坏生物功能分子，使细胞功能受到破坏[16-17]。本试验结果表明，侵染前期，烟粉虱体内的3种保护酶活力迅速上升，被感染的烟粉虱体内的自由基有所增多，机体迅速启动抗氧化酶系统来消除自由基；但到了侵染后期，烟粉虱体内的3种酶活力明显降低，玫烟色棒束孢的侵染使虫体内的抗氧化酶活性受到抑制，从而降低了对自由基的清除能力，这也许是导致烟粉虱感病死亡的重要原因之一。

谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和羧酸酯酶（CarE）是昆虫体内重要的解毒酶，其可以保护昆虫免受亚致死剂量的杀虫剂和其他毒素的危害。本研究结果表明，玫烟色棒束孢在侵染前期对虫体的GSTs和CarE有短暂的诱导作用，因此，在前48 h，GSTs和CarE活力有所增加，随着侵染时间的延长，虫体组织器官受到菌丝的破坏，使解毒酶的分泌受到影响，正常的生理代谢失衡，因此，酶活力显著下降。

综上所述，玫烟色棒束孢侵染对烟粉虱成虫体内保护酶和解毒酶活性均有明显影响。本研究从生化方面解释了玫烟色棒束孢对烟粉虱正常的生理活动的影响。今后还有必要通过石蜡切片和透射电镜进一步了解玫烟色棒束孢对烟粉虱的入侵机制。

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Effects of Isaria fum osorosea Infection on Different Enzyme Activities in the Adult in vivo of Bem isia tabaci

TIAN Jing1，2，DIAOHongliang2，MA Ruiyan2
（1.Departmentof Life Sciences，Lüliang University，Lishi 033000，China；2.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The activitiesofprotectiveenzyme（superoxide dismutase（SOD）,perioxidase（POD）,catalase（CAT））and detoxification enzyme（glutathione S-transferase（GSTs）,carboxylesterase（CarE））of adults of Bemisia tabaci infected by Isaria fumosorosea were studied.The results indicated that activities of SOD,POD,CAT,GSTs and CarE were significantly affected by Isaria fumosorosea.The activitiesofSOD,POD,CAT,GSTsand CarE increased after infection.These valueswere higher than control at the beginning of infection and reached their peaks in 48-60 h,then decreased and significantly lower than control in 84 h.Therefore,the physiological activities of Bemisia tabaci were disturbed by the infection of Isaria fumosorosea.

Isaria fumosorosea;adultof Bemisia tabaci;protectiveenzyme;detoxification enzyme

S433.39

A

1002-2481（2016）07-1007-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.27

2016-02-28

山西省煤基重点科技攻关项目（FT201402）；北京农学院农业部都市农业（北方）重点实验室开放课题（KFK-2015001）；吕梁学院校内基金项目（ZRXN201409）

田 晶（1987-），女，山西浮山人，讲师，博士，主要从事昆虫生理与生物防治研究工作。马瑞燕为通信作者。