北京地区警犬皮肤葡萄球菌分离鉴定及耐药性试验

周传铎 ， 任连权 ， 赵 然 ， 张 迪 ， 周雅楠 ， 李晓晓 ， 林德贵

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京海淀100193 ； 2.北京市公安局刑侦总队警犬技术支队 ，北京大兴102614 ； 3.天津市兽药饲料监察所 ， 天津北辰300402)

北京地区警犬皮肤葡萄球菌分离鉴定及耐药性试验

周传铎1，2， 任连权3， 赵 然2， 张 迪1， 周雅楠1， 李晓晓1， 林德贵1

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京海淀100193 ； 2.北京市公安局刑侦总队警犬技术支队 ，北京大兴102614 ； 3.天津市兽药饲料监察所 ， 天津北辰300402)

犬脓皮病，又称为犬细菌性皮肤病或犬细菌性毛囊炎，为由细菌引起的犬皮肤及其相关结构的感染[1]，系犬常见病之一。该病具有发病率高、疗程长、易复发的特点，加上日益严重的细菌耐药问题，使得该病的治疗愈发困难。而葡萄球菌被认为是引起人与动物化脓感染的主要的病原菌之一[1]。本试验对北京地区警犬脓皮病病例及健康警犬体表皮肤的葡萄球菌进行分离、鉴定及药物敏感性试验，为警犬皮肤病防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料选择 (1)2014年10月-2015年01月，北京地区新发的警犬脓皮病病例18例；(2)北京地区健康警犬50头(体表无化脓感染病灶，其他器官或系统无明显病变)，其中德国牧羊犬、史宾格犬、拉布拉多犬、罗威纳犬、马里努阿犬各10只，雌雄各半，年龄平均分布。

1.2 培养基及试剂 细菌培养所用各种培养基，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；药敏试纸片，分别购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司及北京天坛生物科技有限公司；培养基及其他试剂的配制均按产品说明或常规方法配制；标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、ATCC29213由中国农业大学药理实验室提供；DNA Marker，购自天跟生化科技(北京)有限公司；2*EasyTaqSupperMix，购自北京全式金生物技术有限公司；PCR引物合成及测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。

1.3 细菌的分离、鉴定 (1)脓皮病病例：用无菌生理盐水对病灶表面进行冲洗，用浸有无菌BHI肉汤的棉签蘸取新的脓汁或沿感染灶与健康组织交界处蘸取渗出物，于酒精灯旁接种5%哥伦比亚血营养琼脂培养基；37 ℃恒温培养24 h；根据菌落的形态、颜色、溶血情况等，挑取不同的单菌落转接至新的哥伦比亚血平板，37 ℃恒温培养24 h～36 h；(2)健康犬皮肤：将一次性无菌采样拭子用无菌生理盐水浸湿后，分别对每只犬的右眼眼周、背部正中、左侧腹股沟处皮肤进行采样，并置于7.5%高盐肉汤培养基，37℃孵育24 h～36 h。在超净台中，将培养后的菌液接种于高盐甘露醇琼脂培养基，置37℃恒温箱孵育24 h～48 h。挑取单菌落转接至新的高盐甘露醇琼脂培养基，进一步纯化；(3)挑取单一形态菌落：经染色、镜检后，经BHI肉汤增菌培养，采用水煮法[2]提取DNA，并采用16S rDNA法(通用引物27F、1492R)及生化鉴定法对细菌进行鉴定。

1.4 药敏试验 对分离得到的葡萄球菌采用纸片扩散法进行药物敏感性试验。结果判定依CL.SI(2015修订版)进行。

2 结果

2.1 北京地区警犬脓皮病病原菌的分离鉴定结果 从18例脓皮病患犬患处分离到细菌34株。其中葡萄球菌18株(52.94%)，芽孢杆菌11株(32.35%)，结果见表1。

表1 北京地区脓皮病警犬病原菌鉴定结果

2.2 北京地区警犬健康皮肤葡萄球菌分离鉴定结果 150个采集样本中，共分离出葡萄球菌23株。其中，伪中间型葡萄球菌最多，6株，占26.1%，结果见表2。

表2 北京地区警犬健康皮肤葡萄球菌分离鉴定结果

2.3 脓皮病患病品种统计及健康犬皮肤葡萄球菌与样本间关系 18例警犬脓皮病中，史宾格犬、德国牧羊犬病例数最高，各6例，分占33.33%，拉布拉多犬、马里努阿犬、罗威纳犬分别为3例、2例和1例。而健康犬皮肤分离的23株葡萄球菌，从品种看，7株(30.43%)来自于史宾格犬，占比最高；德国牧羊犬与罗威纳犬均为5 株(21.74%)；马里努阿犬及拉布拉多犬分别为4 株(17.39%)、2 株(8.7%)；从分离部位看，左腹股沟处分离出菌数量最多，为12 株(52.17%)，背部最少4株(17.39%)。

2.4 北京地区警犬皮肤葡萄球菌耐药情况 对脓皮病警犬患处分离的18 株葡萄球菌及健康警犬皮肤分离的23 株葡萄球菌进行药物敏感性试验，全部葡萄球菌均对头孢西丁敏感，结果见表3。多重耐药(同时对3 种及3 种以上药物耐药)的菌株情况见表4。

表3 北京地区警犬皮肤分离葡萄球菌的耐药情况

a：依照CLSI兽医标准；b：金黄色葡萄球菌及路登葡萄菌依表格标准，其他葡萄球菌依S≥25、R≤24标准

表4 北京地区警犬分离葡萄球菌多重耐药情况

3 讨论

3.1 犬皮肤感染致病菌较多，且多为复合感染。在既往的研究中，犬脓皮病分离得到的病原菌并不完全一致，但葡萄球菌，尤其是伪中间型葡萄球菌为犬脓皮病的主要病原菌已成为动物医学界的共识[3-10]，本试验的结果再次证实了这一结论。但试验中，从脓皮病患犬处未分离到链球菌、绿脓杆菌、微球菌、变形杆菌、棒状杆菌等[4-7，9]致病菌，而薛占永等[8]在研究北京地区犬脓皮病的病原菌时同样未分离到链球菌与绿脓杆菌，其原因可能与地域及季节等因素有关。另外，从健康犬皮肤表面分离得到的凝固酶阴性葡萄球菌相对较多，而某些凝固酶阴性葡萄球菌也具有特定致病性，可以引发动物及人感染[11-12]，仍不能忽视。

3.2 从患病犬统计看，史宾格犬、德国牧羊犬为脓皮病发病率最高的品种。从健康警犬皮肤分离的葡萄球菌在犬品种间的分布来看，史宾格犬体表分离到的葡萄球菌最多，与史宾格犬脓皮病发病病例较高相呼应。德国牧羊犬为人们已知的脓皮病易感品种，提示史宾格犬可能也具有脓皮病易感特性，应引起警犬技术人员的重视。

3.3 葡萄球菌为公认的犬脓皮病主要致病菌，故对其进行分离及药物敏感性试验。从试验结果看，所有分离菌株均对头孢西丁敏感，未筛查出耐甲氧西林葡萄球菌；对阿莫西林-克拉维酸、阿米卡星、氟苯尼考也全部敏感，为以后临床提供更多选择；对青霉素G耐药率最高；而常用的皮肤病用药-克林霉素在健康犬皮肤分离葡萄球菌的耐药率仅为 8.70%，但对发病犬分离菌的耐药率提高为 38.89%，提示其可能较易产生耐药性，在用药时要审慎选择。而与近年相关研究结果相比较，分离菌药物敏感性试验结果及多重耐药情况均优于国内薛占永、杨静等[8-9]的试验，与国外研究的耐药情况较为一致[5-7]。但从健康警犬皮肤分离的葡萄球菌耐药情况看，虽然菌株对药物敏感性情况优于脓皮病患犬组，但对所用试验药物全部敏感的菌株仅占26.09%，仍有较多菌株对不同药物耐药，且存在着4株多重耐药菌株，提示警犬皮肤葡萄球菌耐药性存在的普遍性。

4 小结

由试验可知，北京警犬脓皮病病原菌仍以葡萄球菌(伪中间型葡萄球菌)为主，皮肤分离葡萄球菌药物敏感性情况要好于国内平均水平，但仍存在一定的耐药性问题。警犬技术工作人员要加强对警犬皮肤细菌耐药性的监测，重点围绕易感的史宾格犬和德国牧羊犬品种展开脓皮病的预防及治疗工作，合理使用药物，提高脓皮病治疗效果的同时，减少细菌耐药性的产生，更要加强防范，减免动物源性耐药菌向人的传播。

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2015-11-16

周传铎(1982-)，男，兽医师，工程师，博士，从事警犬疾病防治工作，E-mail：zthxc@163.com

林德贵，E-mail：csamam@sina.com

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0529-6005(2016)11-0091-03