基于新一代测序技术对犬肛周腺肿瘤差异表达基因分析

胡 平 ， 郭泽领 ， 林德贵

(1.中国农业大学动物医学院， 北京海淀100193 ； 2.北京农业职业学院， 北京房山102442 ；3.北京观赏动物医院， 北京西城100190)

基于新一代测序技术对犬肛周腺肿瘤差异表达基因分析

胡 平1, 2， 郭泽领1, 3， 林德贵1

(1.中国农业大学动物医学院， 北京海淀100193 ； 2.北京农业职业学院， 北京房山102442 ；3.北京观赏动物医院， 北京西城100190)

犬肛周腺肿瘤(Hepatoid gland tumours)高发于未去势老年公犬， 在雄性犬的肿瘤中发病率排名第三。 本研究采用IlluminaHiSeqTM2500高通量转录组RNA-seq测序技术对犬肛周腺肿瘤的组织和正常肛周腺组织分别进行测序。 发现差异表达基因588个， 其中上调基因23个， 下调基因565个， 差异极显著水平的基因94个。 通过对GO基因功能聚类， 发现生物过程类别基因37个、 分子功能类别24个。 KEGG分析发现有 470个基因涉及信号通路262个。

犬肛周腺肿瘤， 转录组， Illumina测序， 新一代测序

犬肛周腺肿瘤是老年雄性犬高发的一种皮肤肿瘤[1]。肛周腺组织仅存在于犬科动物和有袋类动物(如袋鼠)[2]。国外曾报道该肿瘤在犬的肛门周围发生的肿瘤中发病率可达80%以上，在雄性犬的肿瘤发病率中排名第三[4]。本试验借助新一代测序方法对比肿瘤与正常组织的差异基因，探索犬肛周腺肿瘤发生发展的机制，为肛周腺肿瘤的分子标记物研究提供有益数据[6]。

1 材料与方法

1.1 组织样本采集 2011年1月—2013年12月北京观赏动物医院就诊的肛周腺肿瘤患犬10例，老年雄性犬的正常肛周腺组织6例，摘除手术均在无菌手术室中进行，样本分别在同期实验制成石蜡组织切片和液氮保存。经H.E.染色进行组织病理学观察，证实为犬肛周腺瘤或正常肛周腺组织。在液氮中保存的10例肛周腺肿瘤随机分为2组，6例正常犬肛周组织1组，用于RNA提取。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取和测序文库的建立 将10例肛周腺肿瘤组织随机分为2组，每组5个样本。6个正常肛周腺组织作为正常对照组。按照TRIZol Reagent试剂盒操作说明书提取10个肛周腺肿瘤组织和6个对应正常肛周腺组织的总RNA。将两个肛周腺肿瘤组样本和正常肛周腺组织样本的总RNA进行混合，构建2个肿瘤转录组文库和1个正常肛周腺组织转录组文库，每个文库至少3G数据，三个文库至少9G数据。

1.2.2 测序与数据处理 本实验由北京百欧美生物科技有限公司采用Illumina HiSeqTM2500高通量测序技术，利用双末端(Paired-End)测序法对肛周腺瘤组织文库进行转录组测序。利用Fastqc软件对取得的reads数据进行数据检测和评估。利用tophat(2.0.9版本)软件[7]及bowtie2(2.1.0)软件[8]将犬肛周腺的clean data mapping家犬(Canis lupus familiaris)的基因组中，对测序结果进行比对和注释。

1.2.3 差异表达基因GO和KEGG富集分析 我们利用GOseqR软件包[9]进行差异基因的GO富集分析；并使用Wego[10]绘制 GO 注释结果。对于实验组中的两样品间，将差异基因作为前景，全部基因作为背景，进行KEGG的富集分析，使用超几何分布(phyper)计算前景基因，同Pathway分类中某个特定分支的P值，并用FDR进行校正。

2 结果与分析

2.1 基因表达及差异分析 通过对RNA-seq的数据结果，分析筛选得到了肛周腺肿瘤组和正常组的之间的转录本差异表达基因，以及转录本异构体的表达分布和表达差异情况(Fold changed≥2，p value≤0.001)(如中插彩版图1)。

统计结果发现，肿瘤组于对照组差异表达基因共有588个，其中上调基因23个，下调基因有565个，其中达到极显著水平基因(FC≥2，FDR<0.05)有94个。而转录异构体isoforms中差异转录本有827个，其中上调基因24个，下调基因803个。上调的23个基因包含了已经注释的编码基因3类基因即LYZF2、MMP-1、Ig免疫球蛋白λ链六区类似基因。还有10个注释的非编码小RNA分子即转运tRNA。此外，还发现4个功能未知的新转录。下调基因中，包括未注释基因，核糖体蛋白，非编码RNA(ncRNA)以及抗体Ig和翻译延伸因子类型。这些类型存在许多可能是新型的转录本，比例最高，占45%。其次是核糖体蛋白，占28%。再次是ncRNA，占17%，另外一些翻译延伸因子占6%。按照表达量筛选出上下调最显著的前10个基因(如表1、2)。

表1 RNA-seq中犬肛周腺肿瘤组织中相对正常对照上调的前10个基因列表

表2 RNA-seq中犬肛周腺肿瘤组织中相对正常对照下调的前10位个基因

2.2 差异基因表达基因GO及KEGG富集分析 GO分析表明，共有120个基因得到归类注释，涉及生物过程、细胞组成及分子功能三大类共20个小类。细胞组成大类中涉及10个小类共59个基因，其中cell和cell prat小类所占比例最多包括33个基因，占所有表达基因的10.8%，其次是organelle类别，有8个基因占表达基因总数的2.6%。在生物过程大类中涉及14个小类37个基因，其中细胞过程类别最多出现6个基因占2%，其次是刺激应答反应类别有5个基因，占1.7%。在分子功能大类中涉及3个小类共24个基因，其中binding有14个基因占表达基因总数的4.6%。

KEGG分析表明，共有470个基因涉及262个通路，其中代谢途径通路涉及的基因数目最多，有16个基因，其次为嗅觉途径通路有12个、代谢通路涉及8个，以及癌症信号通路、信号转导通路、PI3K-Akt各涉及7个基因，此外免疫系统途径及MAPK和Proteoglycans in cancer途径各6个基因，细胞因子受体途径5个基因等。

3 讨论

本实验借助Illumina 2500测序平台对犬肛周腺肿瘤的转录组进行测序，发现了一些重要的与癌症相关的基因变化。生物信息研究发现这些基因主要与免疫反应、刺激响应、细胞粘着以及运动和发育等功能有关，这些通路都离不开细胞表面受体和细胞核中转录因子的参与。

3.1 测序技术对犬肛周腺肿瘤与正常犬肛周腺组织分析差异表达基因共有588个，其中上调基因23个，下调基因565个。这些基因中差异极显著的基因有94个，其中下调基因中还包括为一些尚未注释的ncRNA，揭示出这些基因很可能是尚未发现的抑癌基因。

3.2 通过KEGG代谢通路分析，发现有470个基因涉及260个信号通路，发现在这些通路中显著变化的基因如：MMP-1(基质金属蛋白酶-1)、FGF7(成纤维细胞生长因子7)、GST(谷胱甘肽转移酶)、ECM(细胞外基质)等基因可能与犬肛周腺肿瘤的发生、发展具有密切关系。

[1] Hedlund C S, Fossum T W. Anal Neoplasia[M]. Small Animal Surgery，2002：424-428.

[2] I Sitor,Weinman.Origin and early development of canine circumanal glands[J]. Am J Vet Res,1979,40:487-492.

[3] Goldschmidt M H, Dunstan R W. Stannard Histological Classification of Epithelial and MelanocyticTumors of the Skin of Domestic Animals[J]. 2nd series.Armed Forces Institute of Pathology,1998,3-34.

[4] Murphy G F,Elder,D E. Atlas of Tumor Pathology:Non-melanocytic Tumors of the Skin, Rittenhouse Book Distribu, 1991,131.

[5] Berrocal A, Vos J H. van den Ingh. Canine perineal tumors. [J]. Veterinary Medicine, 1989, 36(10):739-749.

[6] 戴维 J，沃特斯, 凯瑟琳·怀尔达辛,徐玉生. 宠物犬攻克癌症的关键 [J].养犬, 2009(03):43-45.

[7] Kim D,G Pertea, C Trapnell, H,etal. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions [J]. Genome Biology, 2013,14(4):R36.

[8] Langmead B, Trapnell C., Pop M,etal. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome [J]. Genome Biology, 2009, 10(3):R25.

[9] Young M. D, Wakefield M J., Smyth G K,etal. Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias [J]. Genome Biology, 2010, 11(2):R14.

[10] Ye J, Fang L, Zheng H,etal. WEGO: a web tool for plotting GO annotations [J]. Nucleic Acids Res, 2006, 34(Web Server issue):W293-297.

[11] Brinckerhoff C E, Rutter J L, Benbow U. Interstitial collagenases as markers of tumor progression [J]. Clin Cancer Res, 2000, 6(12):4823-4830.

Study on Differentially Expressed Gens betweenHepatoid gland and its tumors Based on Transcriptomes with High-throuphput RNA-seq Technology

HU Ping1, 2, GUO Ze-ling1, 3, LIN De-gui1

(1. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2. Beijing Vocational College of Agricultural, Beijing 102442, China; 3. Beijing Guanshang Animal hospital, Beijing 100190, China)

Perianal gland tumor ranks the top 3 among all types of canine tumor types in male dogs. This study employed the high-throughout sequencing technology to analyze the difference of gene expressions between perianal gland tumors and normal perianal gland tissue for the first time. The results showed that there were 588 different lially expressed genes between the tumors experimental group and the control group, including 23 up-regulated genes and 565 down-regulated genes，and the genes with significant difference were 94. Based on GO clustering analysis， the Biological Process cluster included 37 genes and the Molecular Function cluster included 24 genes. KEGG analysis found that 470 genes were involved in 262 signal pathways.

Hepatoid gland tumours ； transcriptome ； Illumina sequencing ； Next-Generation and Sequencing

LIN De-gui

2016-06-01

胡平(1975- )，女，兽医师，博士生，从事小动物临床及动物病理教学工作，E-mail:hpwisdom@163.com

林德贵， E-mail： csamalin@sina.com

S858.292

A

0529-6005(2016)11-0023-03