dalbinol通过ROS/Dvl/GSK-3β/β-catenin信号通路诱导人结肠癌细胞凋亡的作用机制研究

李飞龙，巫 鑫，廖红波，仇双利，朱晓辉，崔 燎，吴 华

(1. 广东医科大学附属医院肿瘤中心，2. 广东天然药物研究与开发重点实验室，广东 湛江 524023)

dalbinol通过ROS/Dvl/GSK-3β/β-catenin信号通路诱导人结肠癌细胞凋亡的作用机制研究

李飞龙1，巫 鑫2，廖红波2，仇双利1，朱晓辉2，崔 燎2，吴 华1

(1. 广东医科大学附属医院肿瘤中心，2. 广东天然药物研究与开发重点实验室，广东 湛江 524023)

目的 探讨天然产物dalbinol对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法 采用MTT法检测dalbinol对人结肠癌HCT116细胞的增殖抑制作用；利用Hoechst 33342荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化；应用流式细胞术检测细胞凋亡率和ROS水平；通过Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路及凋亡相关蛋白的表达情况。结果 dalbinol可抑制人结肠癌HCT116 细胞的增殖，且呈剂量和时间依赖性，24、48和72 h的IC50分别为(4.8±0.53)、(2.5±0.43)和(0.6±0.22) μmol·L-1；Hoechst 33342染色观察到细胞皱缩、核固缩和染色质凝集等典型凋亡的形态学变化，同时dalbinol可剂量依赖性地提高细胞凋亡率，且能增加细胞内ROS水平；Western blot结果发现dalbinol通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表达水平，上调促凋亡蛋白Bax和Bim的表达，从而促进cleaved caspase-3--------------------

dalbinol；结肠癌；HCT116；增殖；凋亡；Wnt/β-catenin

结肠癌是常见的恶性消化道肿瘤之一，发病率和死亡率均位居恶性肿瘤前列，使人类健康面临严重挑战[1]。尽管结肠癌诊疗的技术和水平都有所提高，但患者的5年生存率仍不理想[2]。据统计，1940～2014年间，超过75%的抗肿瘤药物直接来源于天然物质[3]。因此，从天然药物中寻找新型抗癌药物，对改善结肠癌患者预后具有重要意义。研究表明[4]，结肠癌的发生、发展与Wnt/β-catenin、EGFR、p53、MAPK、Notch、RhoA/ROCK 等多种信号通路有关，其中Wnt/β-catenin 信号通路的异常激活被认为是结肠癌的发生、发展的关键事件。Tan等[5]研究发现，通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路的激活，结肠癌细胞可发生增殖抑制和凋亡现象。紫穗槐(AmorphaFruticosa)，落叶灌木，系豆科紫穗槐属，其花和叶均可入药，具有清热、凉血、止血和祛湿消肿等药理作用，中医主要用于湿疹、痈肿和烧烫伤等病症[6]。dalbinol是从紫穗槐中分离纯化的一种鱼藤酮类化合物(结构见Fig 1A)，本课题组的前期研究发现，该化合物在体外对HCT116细胞表现出显著的细胞毒性，但其作用机制尚不明确。因此，本研究进一步观察dalbinol对人结肠癌HCT116细胞周期及凋亡的影响，并分析dalbinol对Wnt/β-catenin信号通路的影响，探讨dalbinol调控Wnt/β-catenin信号通路的可能机制，为其后续开发与利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人结肠癌 HCT116 细胞由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 dalbinol由本课题组提取纯化并鉴定所得[7]。胰蛋白酶、DMEM培养基(高糖型)、胎牛血清均购于美国Hyclone 公司；青霉素-链霉素购自广州威佳科技有限公司；Hoechst 33342染色液、活性氧检测试剂盒、全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光液、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒均购于碧云天生物技术研究所；β-actin抗体购自北京义翘神州生物技术有限公司；β-catenin 抗体购自英国ABC公司；PARP 抗体购自美国Biolegend公司；caspase-3抗体购自美国 Proteintech公司；Dvl-2购于美国Santa Cruz Biotechnology公司。GSK-3β和c-Myc抗体均购于美国 BD公司；GSK-3β(pS9)、Survivin、Bcl-2、Bax、Bim、Mcl-1和Histone3抗体均购于美国CST公司；羊抗兔IgG-HRP和羊抗鼠IgG-HRP均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清和1%(V/V)青-链霉素的高糖型DMEM培养基，于 37 ℃、5% CO2条件下培养HCT116 细胞，按 1 ∶4 隔天传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制作用 取对数生长期细胞接种于96 孔板，不同浓度的dalbinol (0、 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol·L-1)分别作用 24、48、72 h 后，每组设置3个复孔，每孔加入5 g·L-1MTT 10 μL，置孵箱继续培养 4 h，弃上清，加入200 μL DMSO溶液，使用酶标仪在570 nm 波长处检测各孔吸光度值，计算细胞存活率。

1.2.3 Hoechst 33342 荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化 取对数生长期细胞接种于6孔板，将dalbinol稀释成不同终浓度(0.5、1.0、2.0 μmol·L-1)进行加药，每组设置3个复孔，同时设置阴性对照组。孵育24 h 后，PBS 洗 3 遍后每孔各加入 2.5 mg·L-1Hoechst 33342 染色液，在 37 ℃条件下孵育染色 5 min，用 PBS 洗 3 次。倒置荧光显微镜观察细胞形态学变化。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡率 取对数生长期细胞接种于6孔板，质量浓度、加药方式同“1.2.3”项，加药24 h后收集细胞，PBS洗涤2次，将细胞重悬于195 μL的Annexin V-FITC结合液中，室温避光孵育15 min后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混匀。流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.2.5 细胞内 ROS 含量的检测 取对数生长期细胞接种于 6 孔板，质量浓度、加药方式同“1.2.3”项，dalbinol处理12 h后收集细胞，将DCFH-DA荧光探针按1 ∶1 000用无血清培养液稀释，置10 μmol·L-1DCFH-DA于培养箱中孵育30 min，用无血清培养液洗涤细胞3次。流式细胞仪测定细胞内活性氧含量。

1.2.6 Western blot检测相关蛋白的表达 将对数生长期细胞接种于6孔板中，质量浓度、加药方式同“1.2.3”项，加药24 h后收集细胞，提取各实验组细胞总蛋白、核蛋白。BCA法蛋白定量，用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，将分离后的蛋白质转移至NC膜上，用5% 脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗涤10 min，一抗4℃摇床过夜，TBST洗涤3次，每次15 min，HRP标记二抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次15 min，最后在暗室进行化学发光显色和曝光。

2 结果

2.1 dalbinol对HCT116细胞增殖的影响 MTT结果显示(Fig 1B)，与对照组相比，作用24、48和72 h时，dalbinol可抑制HCT116细胞的增殖，呈剂量和时间依赖性(P<0.05)，IC50分别为(4.8±0.53)、(2.5±0.43)和(0.6±0.22) μmol·L-1。

2.2 dalbinol对HCT116细胞凋亡的影响 将dalbinol按不同终浓度(0.5、1.0、 2.0 μmol·L-1)处理HCT116细胞24 h后，Hoechst33342染色后可观察到部分细胞出现细胞皱缩、核固缩、核破碎等典型凋亡的形态学变化(Fig 2)。同时Annexin V-FITC/PI双染结果表明(Fig 3)，与阴性对照组相比，dalbinol可浓度依赖性地增加HCT116细胞凋亡率(P<0.05)。2.3 dalbinol对细胞内ROS水平的影响 DCFH-DA检测结果表明(Fig 4)，dalbinol按不同终浓度(0.5、1.0、2.0 μmol·L-1)作用12 h时，与对照组相比，dalbinol可使HCT116细胞内ROS水平升高，2.0 μmol·L-1dalbinol作用时细胞内ROS水平最高达55.3%，并呈浓度依赖性。

Fig 1 Structure of dalbinol and anti-proliferative effect of dalbinol on HCT116 cells

A:The Structure of dalbinol;B:Anti-proliferative effect of by dalbinol on HCT116 cells.*P<0.05vscontrol.

Fig 2 Morphological changes of apoptosis by dalbinol in HCT116 cells

A:0 μmol·L-1；B：0.5 μmol·L-1；C：1.0 μmol·L-1；D：2.0 μmol·L-1

Fig 3 Effect of dalbinol on apoptosis of HCT116 cells

A:Flow cytometry analysis results;B:The apoptotic ratio was measured by flow cytometric analysis staining with PI.*P<0.05vscontrol

2.4 dalbinol对HCT116细胞中凋亡相关蛋白表达的影响 初步的作用机制表明(Fig 5)，不同终浓度(0.5、1.0和2.0 μmol·L-1)的dalbinol处理HCT116细胞24 h后，促凋亡蛋白Bax和Bim的表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表达水平下降，导致cleaved caspase-3和cleaved PARP同时过度活化，而总的caspase-3 和PARP变化趋势不明显。

Fig 5 Expression of apoptosis-associated proteins by dalbinol in HCT116 cells

2.5 dalbinol对HCT116细胞中 Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响 进一步的作用机制研究表明(Fig 6)，dalbinol可降低HCT116细胞内总的和胞核β-catenin蛋白表达，尤以胞核β-catenin的下降为甚，但对胞质β-catenin的表达无明显影响。此外，dalbinol可降低Dvl-2、GSK-3β(pS9)、c-Myc和Survivin的蛋白表达，总的GSK-3β蛋白表达无明显变化。

3 讨论

随着社会经济的发展，尤其是饮食结构的改变，目前结肠癌已上升为全球发病率最高的恶性肿瘤之一[1]。在过去几十年，外科手术一直是结肠癌的主要治疗手段之一，但在原发肿瘤出现明显症状之前，患者可能己经发生播散或远处转移，另外约50%病例术后 2 年会出现复发和转移，因此大多数结肠癌患者都需要接受化疗。由于外科手术治疗的局限性、放射治疗的剂量限制、化疗药物的毒副作用以及耐药性等因素影响，结肠癌患者的预后仍不理想[2]。从天然药物资源中寻找具有抗肿瘤活性的药物，是近年来抗结肠癌药物研究的热点之一[3]。

Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与许多癌症的发生、发展有着不可分割的联系，其与结肠癌的关系更是密不可分。据报道，90%的结肠癌都存在Wnt/β-catenin信号通路中一个关键调控基因的突变[8]。因此抑制 Wnt/β-catenin信号是抑制结肠癌细胞生长的重要靶点之一[9]，开发针对Wnt/β-catenin 信号通路的抗癌药物已成为研究的热点[10]。大量研究表明，经典模式下，Wnt/β-catenin 信号通路中 LRP5/6、APC、Dvl、GSK3β、Axin或者β-catenin 等基因的突变，会抑制降解复合体(Axin/APC/GSK-3β)的生成，使β-catenin无法降解并在胞质内堆积后转入细胞核，引起核的β-catenin 与转录因子 TCF/LEF 形成复合物，从而激活相应的下游靶基因 c-Myc、Cyclin D1和Survivin 等，最终导致结肠癌的发生和发展[4]。

Fig 6 Expression of related proteins in Wnt/β-catenin pathway by dalbinol in HCT116 cells

本实验Western blot结果发现，dalbinol作用24 h后，HCT 116细胞中总的和胞核β-catenin的表达均下降，尤以胞核β-catenin 下降最为明显，但胞质β-catenin水平无明显变化，这结果表明dalbinol可调控关键蛋白β-catenin的表达。因此，我们推测dalbinol可能通过下调Wnt/β-catenin 信号通路来抑制HCT 116细胞的增殖。另外，Wnt/β-catenin通路的下游靶蛋白c-Myc和Survivin表达均降低，这结果也进一步证实我们的推测。为明确dalbinol调控Wnt/β-catenin通路的具体机制，我们还检测了影响降解复合体生成的相关蛋白Dvl-2、GSK-3β和GSK-3β(pS9)。结果发现，Dvl-2和GSK-3β(pS9)的表达下降明显，而GSK-3β的蛋白水平未见明显变化。上述结果表明，dalbinol可能通过抑制 Dvl-2 的表达，从而使失活型GSK-3β(pS9)的表达下降， β-catenin磷酸化降解增多，最终导致Wnt/β-catenin通路的下游靶蛋白c-Myc和Survivin表达下降。

总之，dalbinol能明显抑制人结肠癌HCT116细胞增殖，并诱导其凋亡，其作用机制可能与细胞内ROS水平提高和抑制Dvl/GSK-3β/β-catenin信号通路有关。本实验仅探讨dalbinol对HCT116细胞的作用，尚未在其它结肠癌细胞系中予以证实，下一步本课题组将继续研究dalbinol对多种结肠癌细胞系中Wnt/β-catenin通路的影响，为其进一步开发提供科学依据。

(致谢：本实验在广东医科大学广东天然药物研究与开发重点实验室完成，感谢吴华教授和巫鑫博士以及各位老师的指导和帮助。)

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dalbinol induces apoptosis of human colon cancer cells through ROS/Dvl/GSK-3β/β-catenin pathway

LI Fei-long1, WU Xin2, LIAO Hong-bo2, QIU Shuang-li1, ZHU Xiao-hui2, CUI Liao2, WU Hua1

(1.CancerCenter,theAffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,ZhanjiangGuangdong524023,China; 2.GuangdongKeyLaboratoryforResearchandDevelopmentofNaturalDrugs,GuangdongMedicalUniversity,ZhanjiangGuangdong524023,China)

Aim To investigate the effects of dalbinol on proliferation and apoptosis of human colon cancer HCT116 cells and its mechanisms. Methods Anti-proliferative effect of dalbinol was evaluated by MTT assay. The morphological changes of apoptosis were observed by Hoechst33342 staining. Apoptotic rate and ROS generation were analyzed by flow cytometry. The related proteins of Wnt/β-catenin pathway and the apoptosis-associated proteins expression were measured by Western blot. Results The growth of HCT116 treated with dalbinol was inhibited in a dose and time dependent manner with IC50(4.8±0.53), (2.5±0.43) and (0.6±0.22) μmol·L-1at 24, 48 and 72 h, respectively. Typical morphological changes of apoptosis such as cell shrinkage, karyopyknosis and nuclear condensation were observed by Hoechst33342 staining. Meanwhile, the apoptotic rate and intracellular ROS generation of dalbinol were both increased dose-dependently. Western blot results showed that dalbinol could activate the expression of cleaved Caspase-3 and cleaved PARP by decreasing anti-apoptotic protein levels such as Bcl-2 and Mcl-1 and increasing pro-apoptotic protein levels such as Bax and Bim, which induced further apoptosis. Moreover, dalbinol can reduce the protein expression of the total and nuclear β-catenin, but not cytoplasmic β-catenin by suppressing the protein expression of Dvl-2 and GSK-3β(pS9), as well as its target proteins c-Myc and Survivin. Conclusion dalbinol can induce apoptosis in colon cancer HCT116 cells by upregulating the intracellular ROS generation and suppressing Dvl/GSK-3β/β-catenin pathway.

dalbinol; colon cancer cells; HCT116; proliferation; apoptosis; Wnt/β-catenin

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.012

A

1001-1978(2016)12-1694-05

R284.1；R329.24；R329.25；R735.350.22

2016-08-19，

2016-09-14

国家自然科学基金青年基金资助项目(No 81503226)；广东省自然科学基金资助项目(No 2KZ16015G)；湛江市科技攻关计划项目基金资助项目(No 2014B01021)

李飞龙(1990-)，男，硕士生，研究方向：肿瘤的诊断、治疗及预防学，E-mail：443608172@qq.com； 吴 华(1966-)，男，硕士，教授，硕士生导师，研究方向：肿瘤的诊断、治疗及预防学，通讯作者，E-mail：1740154717 @qq.com

和cleaved PARP活化裂解，进而诱导细胞凋亡；此外，dalbinol通过抑制Dvl-2和GSK3β(pS9)的蛋白表达，从而降低总的β-catenin和胞核β-catenin的表达，但胞质β-catenin无明显变化，最终下调Wnt/β-catenin通路下游靶蛋白c-Myc和Survivin的表达水平。结论 dalbinol可抑制人结肠癌HCT116细胞增殖并诱导其凋亡，其分子机制可能与提高细胞内ROS水平和抑制Dvl/GSK-3β/β-catenin信号通路有关。