间接免疫荧光抗体技术检测猪肺炎支原体

2017-01-05 09:34:12李颖平
山西农业科学 2016年11期
关键词:菌体支原体染色

李颖平

(晋中职业技术学院,山西晋中030600)

间接免疫荧光抗体技术检测猪肺炎支原体

李颖平

(晋中职业技术学院,山西晋中030600)

研究介绍了间接荧光抗体技术检测猪肺炎支原体的方法。具体操作为:先进行Hep-2细胞和猪肺炎支原体菌株的培养,然后进行间接荧光抗体检测试验,确定抗体工作浓度之后,取病料刮取菌液进行菌株检测。结果表明,检测结果与临床诊断结果一致,这种方法可以用于难确诊病例的诊断,同时根据黏附计数,可以推断感染菌株的毒力,为临床诊断提供有力的依据。

Hep-2细胞;间接免疫荧光;检测;猪肺炎支原体

猪肺炎支原体(Mhp)是猪地方流行性肺炎(Enzootic Pneumoniae of Pigs,EPP)的病原,也是一种全球性广泛传播的病菌,经常与蓝耳病病毒、细小病毒混合感染,给养猪业带来巨大的经济损失,也是猪的重大疫病之一[1]。猪肺炎支原体属于原核生物,没有细胞壁,细胞里没有细胞核,DNA,RNA和蛋白质分布在细胞里,核糖体是其唯一的细胞器,繁殖方式同其他支原体一样,有出芽、裂解、分枝等[2-3]。在实验室通常用吉姆萨或者瑞氏染色的方法检测Mhp,但视野中只能找到淡染的菌体,且由于Mhp呈多型性,很难详细记录菌体数目。如果采用间接免疫荧光技术,情况就大不相同,由于荧光的亮度能清楚观察菌体形态而且可进行客观计数。Mhp侵入动物体时首先黏附于气管上皮细胞和纤毛上,随后对器官组织进一步侵害,利用细胞黏附来检测猪肺炎支原体的方法逐渐被采用。本研究介绍了间接荧光抗体技术检测猪肺炎支原体的方法。

1 材料和方法

1.1 兔抗猪肺炎支原体免疫血清

兔抗猪肺炎支原体免疫血清由江苏省农科院实验室提供。

1.2 Hep-2细胞的培养[4]

Hep-2细胞由江苏省农科院实验室保存。细胞所有的营养液是含10%NCS的无抗生素的RPML1640,置含5%CO2的饱和湿度的细胞培养箱中37℃培养[5-6],待长成单层后,用0.25%胰酶消化,以104ceus/mL的量接种于24孔细胞培养板中,孔中预先加入盖玻片,每孔加入细胞悬液1 mL,当细胞长至80%丰度时,以0.1 mol/L的PBS(pH值7.2)洗涤细胞3次后待用。

1.3 兔抗猪肺炎支原体免疫血清及FITC标记羊抗兔IgG工作浓度确定[7]

以纯培养的猪肺炎支原体在Hep-2细胞上黏附4 h,甲醇固定→分别滴加1∶5,1∶10,1∶20,1∶40,1∶80,1∶160稀释的阳性兔抗猪肺炎支原体免疫血清,置37℃作用30 min后以PBS洗3次,每次3 min→分别滴加1∶5,1∶10和1∶20稀释的FITC标记羊抗兔IgG(购自博士德),37℃作用30 min,用PBS洗3次,晾干后检查菌体荧光染色情况[8-9]。

1.4 特异性检测[10]

以乳酸杆菌的纯培养物在Hep-2细胞上黏附4 h,然后将阳性兔血清进行1∶20稀释,荧光抗体进行1∶10稀释后,对黏附到细胞上的乳酸杆菌荧光抗体染色并观察染色结果[11]。

1.5 抗体检测试验

将阳性猪血清进行1∶10稀释,加入纯培养的猪肺炎支原体,摇匀后,37℃培养2 h,10 000 r/min离心5 min,弃沉淀,留上清然后进行5倍稀释,按1.4方法染色,并做阳性猪血清试验,以阴性猪血清试验为对照[12-13]。

1.6 病料中致病菌的检查

刮取发病动物猪的肺及气管组织上皮细胞病料,按以下步骤操作进行荧光抗体染色检查。

(1)Hep-2细胞黏附猪肺炎支原体30 min,甲醇固定。(2)弃培养液后,PBS洗1次,自然干燥,滴加1∶20稀释的阳性兔抗猪肺炎支原体免疫血清后置37℃恒温培养箱,作用1 h,PBS洗涤3次。加1∶10稀释的FITC标记羊抗兔IgG抗体,37℃作用1 h后,以PBS洗3次[14]。(3)等充分晾干后,置荧光显微镜下观察结果。

2 结果与分析

2.1 抗体最佳工作浓度测定

在检查猪肺炎支原体涂片时,由表1可知,阳性兔血清进行1∶20稀释,FITC标记羊抗兔抗体进行1∶10稀释时效果较好。

表1 FITC标记羊抗兔IgG和猪肺炎支原体血清最佳稀释度的测定结果[15]

2.2 特异性检测

乳酸杆菌的培养物黏附Hep-2细胞培养物中未见有特异性的荧光着染,只有少量细菌呈暗淡的红黄色。在荧光显微镜下猪肺炎支原体呈单个球状或成堆以椭球形聚集,菌体周边为很强的蓝绿色荧光,极易与其他杂菌分开,后者较大[2]。

2.3 抗体检测试验

用纯培养的猪肺炎支原体对阳性猪血清进行反应处理后,特异性的荧光消失,可知间接荧光抗体检查猪肺炎支原体具有特异性[16]。兔血清应该选用抗兔血清的荧光抗体,猪血清应该选用抗猪血清的荧光抗体,本试验选用兔血清,所以,后来用抗兔血清的荧光抗体,这种检测方法特异性要求很高[17]。

2.4 组织中菌体检查[5-6]

表2 肺脏细菌检查结果

取气管和肺进行荧光抗体染色检查[18],结果列于表2。没有感染猪肺炎支原体的猪肺部和气管没有检测到猪肺炎支原体菌体,而发病动物1号猪明显检测出猪肺炎支原体的存在,与临床诊断结果一致。

3 结论

本试验对实验室培养猪肺炎支原体菌株以及采集的发病动物病料进行了间接免疫荧光技术的检测,取得了满意的效果。与其他染色方法比较,间接免疫荧光抗体标记的菌体形态清晰,可以为以后临床诊断提供有力的依据。

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Indirect Immunofluorescence Antibody Technique to Detect the Pig Pneumonia Mycoplasma

LI Yingping
(Jinzhong Vocational and Technical College,Jinzhong030600,China)

This article introduces the Hep-2 cells adhesion pig pneumonia mycoplasma,and uses indirect fluorescent antibody technique to detect the pig pneumonia mycoplasma.Specific operation is to Hep-2 cells and pigs,the cultivation of pneumonia mycoplasma strains,and indirect immunofluorescence antibody testing experiment,determine the antibody working concentration,scrape a gas-bacilli take epidemic materials according to the determination of the concentration in front of the tested strains.The result shows that test results are consistent with clinical diagnosis,so this method can be used in the diagnosis of difficult cases confirmed,at the same time according to the attached count can infer that infected with strains of virulence.

Hep-2 cells;indirect immunofluorescence;test;swine pneumonia mycoplasma

S858.28

A

1002-2481(2016)11-1702-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.30

2016-09-02

李颖平(1980-),女,山西阳泉人,讲师,主要从事生物化学与分子生物学教学及科研工作。

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