餐桌剩余食物中生物胺形成及其检测与控制技术研究进展

■蔡云霞 韩 晴 李 俊*

（1.中国农业科学院饲料研究所，北京100081；2.北京嘉博文生物饲料科技有限公司，北京 100085）

生物胺（biogenic amine，BA）是一类具有生物活性的小分子量含氮有机化合物的总称。根据其化学结构可分为：脂肪族，包括尸胺、腐胺、精胺、亚精胺、胍丁胺等；芳香族，包括酪胺、苯乙胺、多巴胺等；杂环类，包括组胺、色胺等[1]。

在动植物体内均含有少量生物胺，但更广泛存在于各种加工食品、饮品中，也是合成荷尔蒙、生物碱、核酸和蛋白质等的前体物质。体内的生物胺能够调节细胞生长，作为炎症的介质（组胺）等，维持机体正常的生理功能。但是过量摄入生物胺或者在体内蓄积较高含量则会对生物体产生很大危害，常见会引起头痛、腹部痉挛、血压异常、呼吸困难、心悸、呕吐等不良生理反应。生物胺能够与亚硝酸盐反应，生成强致癌物质亚硝胺，因此生物胺亦被认为有潜在致癌性[2]。其中，组胺在中枢神经系统中是一种神经调质或神经递质，而过量的组胺会引发头痛、消化功能紊乱、血压异常和血管神经水肿等[3]。酪胺的毒性次之，过量后往往与偏头痛和高血压等症状相关。尸胺和腐胺毒性较低，但能通过抑制组胺和酪胺的代谢酶活性，增加组胺和酪胺的潜在毒性[4]。目前，针对食品中生物胺的毒性作用、对食品新鲜度（或腐败度）的指示作用、分析检测、形成机理及控制方法均有较深入的研究。但是在饲料行业中生物胺除对鱼粉等动物性蛋白饲料原料的新鲜度的评价外，鲜有文献可查。

餐桌剩余食物，是指在营业性餐厅中，服务人员在客人用餐结束后，按分类要求及时收集的餐桌上剩余的食物。其中餐厅是经过调查和质量评估后，认定的能达到饲料化资源利用分类要求的餐厅，包括营业性餐饮单位和学校、部队、工厂、办公区的食堂。餐桌剩余食物富含大量的有机质，主要组成内容是米面、蔬菜、肉蛋、骨头、菜汁、废弃油脂等，其主要化学成分是蛋白质、脂肪、淀粉、纤维素等有机物，还含有丰富的矿物元素。餐桌剩余食物是食品废弃物中的一类，有较高的回收价值，同时是不可多得的潜在饲料资源，可以替代大量的蛋白及能量原料[5-6]。但由于各地的政策规定和限制，餐桌剩余食物饲料化资源利用的数量很少。

本文对餐桌剩余食物中生物胺的产成途径，餐桌剩余食物中生物胺的检测方法进行了综述，以期为餐桌剩余食物饲料化资源利用提供参考。

1 餐桌剩余食物中生物胺的形成途径

根据餐桌剩余食物中生物胺的来源不同，可将其分为两种合成途径[7]：第一种是内源性生物胺，通常含量比较低，例如：非发酵食物中含有的部分生物胺等；第二种是餐桌剩余食物中的游离氨基酸在微生物产生的氨基酸脱羧酶作用下脱羧生成（见图1）。

图1 蛋白质到生物胺的形成途径

2 餐桌剩余食物中生物胺形成的三大要素

一般来说，餐桌剩余食物中的生物胺大多由第二种途径产生。餐桌剩余食物在生产、运输及储存过程中，受到具有氨基酸脱羧酶活性的微生物的污染，在这些微生物的作用下脱去氨基酸上的羧基而生成。该途径生成生物胺需有三大要素：游离氨基酸（生物胺的前体物质），产生氨基酸脱羧酶的微生物，适宜微生物生长的环境[8]。

2.1 微生物

餐桌剩余食物富含的有机物有利于微生物的生长[9-10]，在适宜的环境条件下，微生物能够大量繁殖，引起腐败变质。但是餐桌剩余食物成分复杂且差异大，导致引起食品腐败的微生物类群不同。蛋白质含量较高的餐桌剩余食物，容易受到假单胞菌属、变形杆菌属、链球菌属等蛋白质分解能力强的微生物的污染而腐败；糖类含量较高的餐桌剩余食物，更易受到酵母属、曲霉属、青霉属等对碳水化合物分解能力较强的微生物的污染而变质；同时餐桌剩余食物在收集、储运过程中极易受大肠杆菌、沙门氏菌等病原微生物的污染[11]。

上述餐桌剩余食物容易受到污染的诸多微生物中，只有具有脱羧酶活性的微生物能够促进生物胺的产生。有研究表明，食品中能产生生物胺的微生物种属主要包括：乳酸杆菌属、肠杆菌属、链球菌属、肠球菌属、酒球菌属、摩根氏菌属、假单胞菌属及梭菌属等。其中产生组胺的主要有乳杆菌属、肠杆菌属、酒球菌属等；产生酪胺的主要有乳酸杆菌属、肉杆菌属、酒球菌属、肠球菌属等；产生尸胺的微生物主要有芽孢杆菌属、链球菌属、李斯特菌属、哈夫尼菌属、埃希氏菌属、梭菌属、弧菌属、志贺氏菌属等；产生腐胺的主要有假单胞菌属、弧菌属、耶尔森菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属及埃希氏菌属等[12-14]。

张严化(2015)[15]用变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE）方法检测模拟餐桌剩余食物样品的优势菌，发现优势菌种类从下餐桌开始就存在并随时间变化，魏斯氏菌是餐桌剩余食物中主要的优势菌群。在30℃恒温处理下，餐桌剩余食物中的优势菌群主要以假单胞菌属、乳酸杆菌属和链球菌属等嗜温性细菌为主，而10℃恒温处理下，餐桌剩余食物中的优势菌群主要以能在低温环境下生长繁殖的热死环丝菌和假单胞菌为主。

总体上看，具有氨基酸脱羧酶活性的微生物的存在是餐桌剩余食物中生成生物胺的一个重要因素。而魏斯氏菌能够与葡萄糖反应产生乙醇，乙醇含有组胺和二胺氧化酶（DAO）抑制物，阻止组胺的代谢进程，进一步增加了餐桌剩余食物的毒性风险。

2.2 游离氨基酸

作为生成生物胺的前体物质——游离氨基酸同样必不可少。餐桌剩余食物大部分经过高温烹饪，自身就存在一部分游离氨基酸，加上储存及运输过程中伴随着蛋白质的水解作用，进一步加强了游离氨基酸和多肽的生成，给脱羧反应发生提供了充足的底物。

不同基质自体能产生的氨基酸等反应底物也不一致，毛文成[16]在不额外添加发酵微生物的情况下，对餐桌剩余食物30℃恒温处理72 h，检测恒温过程中生物胺的含量变化。发现米面型餐桌剩余食物中尸胺的含量随时间变化增长明显，40 h后趋于稳定，含量达到400 mg/kg，组胺、酪胺、腐胺含量均有增加，但增幅不大；而蛋白质含量较高的肉菜型餐桌剩余食物中尸胺、组胺、酪胺的含量相对米面型较高，并随时间变化增长明显，其中尸胺38 h时达到了580 mg/kg。结果表明餐桌剩余食物都含有较高的反应底物条件，基质不一样游离氨基酸也不同，与此同时，餐桌剩余食物的蛋白含量越高，产生生物胺的风险就越大。

2.3 环境因子

餐桌剩余食物在运输、储存过程中还受到其他因子的影响，比如水分含量、温度、pH值、盐的浓度、渗透压等。

①温度的影响：在其他因素一致的情况下，在0～30℃之间，温度上升，生物胺形成速度加快；Joosten[17]将相同的两组干酪分别在不同温度下成熟1年，9℃保存的一组干酪组胺的含量为2.2 mmol/kg，21℃保存的另一组为 6.8 mmol/kg，组胺含量远高于低温组。Pinho等[18]将Azeitao干酪样品4℃存放2周后，样品中生物胺和游离氨基酸的含量均差异不显著（P＜0.05）；而25℃存放两周后，生物胺的含量显著升高（P＜0.05）。张潇等[19]使用不同的温度发酵鮓鱼，从10℃升高至25℃，随着发酵温度的上升，酪胺、腐胺、尸胺、亚精胺和2-苯乙胺这五种生物胺的含量均呈上升趋势并差异显著（P＜0.05），这5种生物胺总和在10℃发酵的成品是38 mg/kg，在25℃发酵成品达到了45.9 mg/kg。因此从控制的角度看，低温能够减缓生物胺的形成。

②盐浓度的影响：盐度对生物胺合成的影响跟产生脱羧酶的微生物类群有关。Joosten[17]对比两组含盐量不同的干酪时，发现含盐量4.9%的干酪生物胺的含量为3.5 mmol/kg，含盐量2.6%组的干酪生物胺含量为2.1 mmol/kg。但是张潇等[19]在鮓鱼发酵过程中，将NaCl添加量设为1%、3%和5%，NaCl添加量提高加强了对生物胺形成的抑制效果。在盐浓度一致时，使用混合盐（NaCl∶KCl=4%∶1%），比单纯使用5%NaCl更能显著控制生物胺的含量（P＜0.05），魏延玲等[20]在风干鲈鱼的研究中证实该结论。可能混合盐对部分微生物的生理活性抑制效果更好，致使微生物的新陈代谢减缓，脱羧酶含量和活性降低。

③ 糖度的影响：张潇等[19]在鮓鱼发酵过程中，将混合糖（蔗糖∶葡萄糖=1∶1，m/m）的添加量由0.5%提高至6.5%，酪胺等5种生物胺总含量由60.04 mg/kg减至43.37 mg/kg，呈递减的趋势。混合糖提供了微生物需要的营养物质，添加量增加，有利于接种的微生物快速增殖，菌体代谢增快，产生的有机酸使体系的pH值下降，从而抑制有害菌的增殖。

④pH值的影响：餐桌剩余食物的pH值在4.0～5.5之间时，氨基酸脱羧酶的酶活性比较高，但pH值过低时能够抑制微生物菌的氨基酸脱羧酶活性，甚至杀死微生物。pH值较低时会引起微生物细胞膜电荷的变化，微生物对营养物质的吸收受阻，影响了微生物的生长和氨基酸脱羧酶的活性，从而降低生物胺的生成。

3 餐桌剩余食物中生物胺的检测方法

随着对生物胺研究的深入，目前已经积累了大量的生物胺的检测方法，其中色谱法使用的较多：薄层色谱法、离子色谱法和高效液相色谱法等。其他比较多见的有毛细管电泳法、电化学分析法等。

3.1 薄层色谱法（TLC）

薄层色谱法主要用于检测在高温条件下易发生化学变化或是挥发性较小的物质。TLC方法操作简单快捷,而且耗费较低,常用于食品中生物胺的定性和半定量测定,本方法的定量结果准确度偏低,应用相对较少，但用于部分加工企业可以有效降低生物胺监控成本[21]。Shalaby[2]采用半定量薄层色谱法对食品中腐胺、组胺、酪胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺和亚精胺这8种生物胺进行了同时测定。Shakila等(2001)[22]检测鱼肉中组胺、尸胺和腐胺含量时，用5%三氯乙酸溶液（TCA）提取鱼肉中的生物胺，利用丹磺酰氯衍生，用展开剂（三氯甲烷∶三乙胺=100∶25，V/V）在薄层板上展开，在365 nm波长条件下检测。Lapa-Guimaraes等[23]采用了多次展开的方式，首先使用展开剂（三氯甲烷∶乙醚∶三乙胺=6∶4∶1，V/V/V）进行第一次分离，接着用（三氯甲烷∶三乙胺=6∶1，V/V）进行第二次分离，在330 nm波长条件下定量检测，该方法分离生物胺效果好。

3.2 反向高效液相色谱法（RP-HPLC）

高效液相色谱检测法（HPLC）具有定量分析准确、检测灵敏度高、重现性好的特点，是现阶段分析定量生物胺的主要手段。由于生物胺本身不含发色基团，而需要柱前或柱后衍生化，多数学者常选用丹磺酰氯、苯甲酰氯、邻苯二甲醛（OPA）等作为衍生剂的柱前衍生。生物胺检测的检测器选择则包括：紫外检测器（UV）、荧光检测器（FLD）、二极管阵列检测器（DAD）、蒸发光散射检测器（ELSD）等。紫外检测器是RP-HPLC最常用的一种检测器，灵敏度较高；荧光检测器具有更高的灵敏度和选择性。赵中辉等[24]用高效液相色谱法搭配G1321A荧光检测器检测牙鲆体内生物胺，最低检出限达1.5 μg/l；二极管阵列检测器也有用于食品中生物胺的检测[25]；蒸发光散射检测器不依赖于样品的光学特性即可相应，可以节省生物胺检测需要的衍生过程[26]。

3.3 离子色谱法（IC）

离子色谱主要利用离子之间对离子交换树脂亲和力的差异而进行分离，也属于高效液相色谱法之一。常用于阴、阳离子的分析，具有快速、灵敏度高的特点。与反向高效液相色谱（RP-HPLC）法相比，该方法一般采用柱后衍生装置，提高了分析方法的稳定性和重现性[27]。姜荷等[28]建立了离子交换色谱法测定水产品中组胺、酪胺等(2012)10种生物胺含量，组胺检出限为20 μg/kg，灵敏度较高，且回收率在91.2%～102.5%。李刚等(2014)[29]建立适用于水体生物胺（腐胺、尸胺、组胺、精胺、亚精胺）检测的离子色谱检测方法，生物胺检出限＜6 μg/l。

3.4 毛细管电泳法（CE）

毛细管电泳技术兼顾电泳和色谱技术的优点，分析高速高效、灵敏度高、进样量小，可以多组分同时测定。多样的分离模式以及可以与不同的检测器联用，促使毛细管电泳技术在环境、食品、医药、DNA等分析领域得到了广泛的应用。在生物胺检测中，毛细管带电泳法和胶束电动色谱应用较多[30]，毛细管区带电泳技术可以避开衍生化过程直接对生物胺进行分析测定，缩短了样品前处理的时长，但与RP-HPLC和离子色谱相比，其检出限及重现性还需要优化。钱勇强等[31]建立了毛细管电泳-电化学发光检测方法来检测鱿鱼丝中的组胺含量，检出限为0.468 μmol/l，同时体现了较高的重现性，可见毛细管电泳法在生物胺检测应用上有巨大的潜力。

3.5 生物传感器法（Electrochemical biosensor）

生物传感器对生物材料（酶、微生物、抗体、组织等）敏感，并通过理化换能器（光敏感、压电晶体等）将生物材料的浓度转换成电信号，从而进行定性和定量分析，该方法具有简便、快速、选择度高的特点。在生物胺测定中酶生物传感器法用的比较多。Draisci等(1998)[32]用胺氧化酶催化生物胺生成对应的过氧化氢、醛类等产物，同时测定8种生物胺的含量，该方法仍存在酶特异性、成本高、难保存等问题，现阶段大规模应用存在局限性。除酶以外，Fiddes等(2014)[33]利用顺丁烯二酸酐与生物胺反应，射频识别标签作为应答器，成功检测了食品腐败过程中的生物胺含量。

目前，针对餐桌剩余食物中生物胺检测方法的研究并不多。毛文成[16]建立并优化了餐桌剩余食物中腐胺、尸胺、精胺、组胺和酪胺等5种生物胺的RPHPLC法。该方法用5%三氯乙酸溶液提取生物胺，正己烷脱脂，苯甲酰氯衍生化后，利用Waters2695高效液相色谱仪，在紫外波长254 nm条件下进行检测。在0.1～50 μg/kg范围内线性关系良好（R2＞ 0.994），各类生物胺检出限为0.1～0.5 μg/kg，样品的加标回收率为67%～120%。该方法适用于餐桌剩余食物中生物胺的定性及定量分析工作，为餐桌剩余食物饲料化研究工作奠定了基础。

4 生物胺可作为判断餐桌剩余食物可饲料化利用的重要指标

摄入过量的生物胺会引起动物机体中毒,但目前还未确定如何准确衡量生物胺的毒性[34]。主要是由于生物胺的种类繁多，其毒性差别较大，无法根据生物胺总含量来确定毒性。而且生物胺之间还存在着一定的相互转化，毒性也受到其他各类生物胺含量及胺类氧化酶的影响。另外，不同动物机体对生物胺的耐受力不一致，肠道对生物胺的解毒能力不一致，直接影响到中毒剂量。因此，无法统一制定生物胺限量标准，但已有部分国家尝试根据不同食品的特性制定生物胺的限量标准，针对其中毒性最大的生物胺——组胺设定了上限，例如中国，在鲐鱼中组胺含量不得超过1 000 mg/kg，其它海水鱼中组胺含量不得超过300 mg/kg[35]；欧盟制定的关于水产品中组胺含量的标准为不得超过100 mg/kg[36]。其中酒类中组胺要求更严格，欧洲各国制定的葡萄酒中的组胺含量标准均低于10 mg/l，其中德国为不得超过2 mg/l[37]，主要是因为乙醇（特别是红酒）富含组胺和二胺氧化酶（DAO）抑制物，DAO使机体的组胺降解能力减弱，从而使组胺累积过量引起中毒。

餐桌剩余食物在运输、储存和处理过程中，其蛋白质在腐败过程中会持续产生生物胺，故生物胺的含量还与蛋白质的含量具有相关性。米面型餐桌剩余食物产生的生物胺含量较低，肉菜型产生的生物胺含量较高。餐桌剩余食物中的生物胺含量也与其腐败状态有关，首先利用感官判断餐桌剩余食物的腐败状况，再结合腐败进程中所测的生物胺的值，推荐当餐桌剩余食物中的生物胺含量达到最高含量的50%时，作为餐桌剩余食物已经腐败的定量值。另外，生物胺中尸胺在餐桌剩余食物腐败中产生量较多且变化较大，因此可以选择尸胺作为筛选餐桌剩余食物的特征性指标[16]。

5 生物胺的控制

生物胺具有较高的热稳定性，长时间加热或者烹饪并不能消除已经合成的生物胺[38]。在发酵食品（香肠等）加工行业，常用的手段是通过冷冻、辐射、添加食品添加剂（如防腐剂）等来抑制微生物的生长[39]，从而减少食品中生物胺的累积。因此，从源头控制生物胺生成十分重要，目前最有效的方法是通过控制生物胺形成的三个要素，并加速生物胺的降解[12]。

5.1 控制游离氨基酸的含量

餐桌剩余食物饲料化利用时，如果确定腐败仍在可接受的范围内，那么在饲料化加工过程中应该尽量控制生物胺含量的继续增长。理论上认为纯蛋白质是不含氨基酸的，当基质中含一定的水分时基质中的蛋白质就容易水解转化为氨基酸，但当温度超过50℃就不再生成氨基酸。水分的降低很难在短时间完成，可以通过添加较干的物料来相对降低基质整体的水分含量，或采用超过50℃的温度加热来控制餐桌剩余食物中游离氨基酸的产生。

5.2 控制产氨基酸脱羧酶的微生物的增殖

微生物菌从餐桌剩余食物下餐桌开始就在不停地生长繁殖，控制好产氨基酸脱羧酶的微生物就能从根本上控制生物胺含量。通过灭菌可有效控制餐桌剩余食物中的微生物含量，通常灭菌需要根据灭菌的基质不同，采用不同的灭菌方式。餐桌剩余食物水分含量高，质地黏稠，通透性差；并富含蛋白、脂肪、纤维等营养成分，灭菌方法的选择需减少对蛋白质等营养成分的破坏并且达到均一性。现阶段国内餐桌剩余食物饲料化利用采用的灭菌工艺主要为常压及高压蒸煮灭菌。在常压下利用沸水和蒸汽的温度灭菌，30～60 min可杀死细菌繁殖体，但部分芽孢有强耐热性，该条件下不能完全杀灭。国内某企业采取的灭菌方式是90℃蒸煮20～30 min。此种方法更倾向于将原始的餐桌剩余食物直接蒸煮后饲喂动物，不适合工业化生产。Yiying Jin等[40]将餐桌剩余食物在110℃下湿热处理60 min，可有效降低金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，菌落总数等卫生指标，达到餐桌剩余食物饲料化的灭菌要求。

5.3 控制氨基酸脱羧酶的活性

可以通过低温运输储存、pH值调节、接种有益菌种控制产氨基酸脱羧酶的微生物活性等方式控制生物胺的产生。盐度及糖度的改变不适合用于餐桌剩余食物中生物胺的控制，主要是餐桌剩余食物本身的盐的浓度偏高，如果再增加盐的浓度，会直接影响饲料化产品的适口性，并增加调配全价饲料配方的难度。

5.4 增强生物胺的降解水平

除控制生物胺的形成因素外，还可以通过酶解法加速降解已经生成的生物胺，使生物胺维持在低含量水平。已见报道的降解酶有胺氧化酶和胺脱氢酶[12]。胺氧化酶通过催化生物胺氧化脱氨生成乙醛、氨和过氧化氢，胺脱氢酶通过催化生物胺脱氨生成乙醛和氨，这两种酶在使用仍有一些药物和特定条件的限制，同时能够降解生物胺的菌株的筛选和酶的纯化还需要投入大量的基础研究工作。

6 展望

餐桌剩余食物中营养物质丰富，蛋白含量高，产生物胺的微生物种类多，各类微生物产生物胺的能力不同，各类群微生物共生时存在一定的协同或拮抗作用，同时还会受到环境因素的影响。因此需要在第一时间对微生物所产生的生物胺进行快速、准确的定量分析，并通过一系列的方法减少生物胺的继续产生。适宜时，添加胺氧化酶或产胺氧化酶的微生物降解已有的生物胺。

为保障餐桌剩余食物饲料化产品的安全，防止过量的生物胺对养殖动物产生不良的影响，还需要对餐桌剩余食物中产生物胺的微生物进行系统研究。建立优化生物胺产生菌的快速检测方法，制定餐桌剩余食物饲料化原料中生物胺限量标准，研发工业化高效杀灭微生物的工艺与设备，并建立有效的餐桌剩余食物饲料化安全评价体系。