鳗鲡中甲基睾酮的二维液相色谱检测方法研究

牛曰华，陈庚，黄东仁，邹红梅，康建平，张天闻

(福建省海洋环境与渔业资源监测中心，福建 福州 350003)

鳗鲡中甲基睾酮的二维液相色谱检测方法研究

牛曰华，陈庚，黄东仁，邹红梅，康建平，张天闻*

(福建省海洋环境与渔业资源监测中心，福建 福州 350003)

针对鳗鲡样品中油脂含量较多，采用常规液相色谱分析时易产生干扰的状况，建立了鳗鲡样品甲基睾酮的在线二维液相色谱检测方法。样品用乙醚提取、硅胶固相萃取柱净化后，用二维液相色谱进行检测。选择C8柱和C18柱分别作为一维和二维色谱柱，构建二维分离体系。通过中心切割技术将一维色谱柱上的目标馏分转移到二维色谱柱上进行进一步的分离。实验结果表明，构建的二维液相色谱系统稳定性良好，建立的二维液相色谱方法可以实现甲基睾酮和基质干扰物的充分分离，检测结果准确可靠，适合鳗鲡样品中甲基睾酮的测定。本研究解决了用常规液相色谱法检测高油脂含量的鳗鲡样品中甲基睾酮残留时经常出现的干扰问题，是对现有水产品中甲基睾酮残留的液相色谱检测方法的有益补充。[中国渔业质量与标准，2016,6(2):38-44]

鳗鲡；甲基睾酮；二维液相色谱；中心切割

甲基睾酮(methyltestosterone，MET)是一种人工合成的类固醇类雄性激素，曾被用于水产养殖行业，可促使苗种向雄性转变[1-2]以及提高饲料的转化率，从而起到促进生长和提高产量的作用。但甲基睾酮具有极大的危害性，其在动物体内代谢缓慢，可通过食物链进入人体，扰乱人体的激素平衡，此外还具有影响胎儿发育、引发新生儿溶血及黄疸、损害肝脏以及致癌、致畸等作用[3-4]。欧盟等许多国家禁止在养殖中使用甲基睾酮。中国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中也将甲基睾酮列为禁用药物，在所有食品动物的可食组织中均不得检出。

水产品中甲基睾酮的检测方法主要有液相色谱-串联质谱法[5]、液相色谱法[6-7]、酶联免疫法[8]等。中国水产行业标准SC/T 3029—2006[6]中甲基睾酮残留量检测方法为液相色谱法，其在水产品药残检测中应用广泛，该方法被用于农业部水产品质量安全监督抽查中水产品的甲基睾酮残留检测。甲基睾酮由于极性较小，脂溶性较强，提取后杂质较多，需要进行进一步的净化处理。常用的净化方法有石油醚和正己烷液液萃取净化[6-7,9]，HLB柱[10]、C18柱[11-12]、硅胶柱[13]、氧化铝柱[14]等固相萃取柱净化以及冷冻离心净化[15]等。在用液相色谱法进行检测时，上述净化方法对油脂含量较低的水产品如鲫、罗非鱼、虾等净化效果较好，但对鳗鲡等一些油脂含量较高的水产品来说，净化效果往往并不理想，经常存在较大干扰，影响了定性和定量检测结果的准确性。

二维液相色谱(two-dimensional liquid chromatography, 2D-LC)是将分离机理不同而又相互独立的两根色谱柱连接起来构成的分离系统。样品经第一维色谱柱初步分离后，通过接口切换技术进入第二维色谱柱中进一步的分离。与一维色谱相比，二维色谱的分辨率和峰容量有很大提高，对于分离复杂样品，具有明显的优势。因此，二维液相色谱及其联用技术在食品科学[16-18]、医药卫生[19-22]、生命科学[23-25]等领域取得了较为广泛的应用。本实验对在线二维液相色谱检测日本鳗鲡(Anguillajaponica)中甲基睾酮的方法进行了研究，通过中心切割技术将第一维中目标物附近不能完全分离的组分转移到第二维中，实现了目标物和基质的充分分离。相较于传统的液相色谱法，二维液相色谱可以简化样品的前处理过程和提高检测结果的准确性。本研究解决了用常规液相色谱检测高油脂含量的鳗鲡样品中甲基睾酮残留时经常出现的干扰问题，是对现有水产品中甲基睾酮残留液相色谱检测方法的有益补充。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和材料

LC-20A二维液相色谱系统(日本岛津公司)，配备系统控制器(2套)、二元高压泵(2套)、稀释泵、自动进样器、柱温箱(配有2个六通阀)、紫外检测器、二极管阵列检测器；3-30K高速离心机(德国Sigma公司)；LR4000旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)；超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；MS5涡旋混合器(德国IKA公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)等。

甲基睾酮标准品(纯度大于99%，德国Dr公司)；乙醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈，均为HPLC级；无水硫酸钠，AR级，经650 ℃灼烧4 h，冷却后贮存于密封容器中备用；硅胶固相萃取柱，规格为0.5 g/6 mL，使用前依次用6 mL丙酮和6 mL正己烷活化，并保持柱体湿润。

日本鳗鲡(Anguillajaponica)样品采自福建省福清市和长乐市相关养殖基地。

1.2 样品处理

鳗鲡取可食部分，充分匀浆。称取5.00 g样品(精确到0.01 g)于50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL乙醚，涡旋振荡1 min，然后再加入10 g无水硫酸钠，再次涡旋振荡提取1 min，5 000 r/min离心5 min。上层清液转移至150 mL棕色鸡心瓶中。残渣重复提取一次，合并提取液，35 ℃旋转蒸发至近干。用6 mL正己烷/乙酸乙酯(9∶1，V/V)分2次溶解，过活化好的硅胶固相萃取柱，流速控制在小于1 mL/min。样液流完后依次用5 mL正己烷和5 mL正己烷/乙酸乙酯(9∶1，V/V)淋洗。最后将硅胶柱压干，用8 mL丙酮/正己烷溶液(4∶6，V/V)进行洗脱，洗脱液35 ℃旋蒸至干，1.00 mL流动相定容，过0.22 μm滤膜，上机检测。

1.3 仪器条件

第一维色谱条件：Agilent XDB-C8柱，规格150 mm×4.6 mm，粒径5 μm；流动相为水-乙腈(55∶45,V/V)；柱温为40 ℃ ；流速为1.0 mL/min；进样量为30 μL； 检测波长为254 nm； 中心切割时间为7.0～8.4 min。

第二维色谱条件：Shim-pack VP-ODS柱，规格250 mm×4.6 mm，粒径5 μm；流动相为水-乙腈(50∶50，V/V)；流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm。

捕集柱：Shim-pack GVP-ODS柱，规格5 mm×2 mm。

稀释泵设置：流动相为超纯水，0～6.00 min，流速为0 mL/min；6.50 ～8.40 min，流速为5 mL/min； 8.41 min以后，流速为0 mL/min。

阀设置：0.01～5.00 min，设置左阀，使第一维色谱柱和捕集柱处于断开状态，设置右阀，使第二维色谱柱和捕集柱处于串联状态，如图1所示，此时样液流经第一维色谱柱，进行初步分离；5.00～7.00 min，设置右阀，使第二维色谱柱和捕集柱处于断开状态，此时稀释泵打开；7.00～8.42 min，设置左阀，使第一维色谱柱和捕集柱处于串联状态，如图2所示，此时对包含目标组分在内的一段组分进行中心切割，将这些组分转移到捕集柱上；8.42 min以后，设置右阀，使第二维色谱柱和捕集柱处于串联状态，如图3所示，此时组分进入第二维色谱柱进行再次分离。

图1 第一维色谱分离时的仪器流路示意图Fig.1 Schematic diagram of instrument flow of the first dimensional chromatography

图2 中心切割时的仪器流路示意图Fig.2 Schematic diagram of instrument flow in heart-cutting

图3 第二维色谱分离时的仪器流路示意图Fig.3 Schematic diagram of instrument flow of the second dimensional chromatography

2 结果与讨论

2.1 在线二维色谱系统的构建

二维液相色谱通常采用两种不同分离机理的色谱柱分析样品，使一维色谱系统中不能分离的组分在二维色谱系统中实现分离。一维色谱和二维色谱分离机理的差异性越大，分离能力越强。最理想的二维色谱系统就是一维是正相分离模式，另外一维是反相分离模式，即NPLC×RPLC模式，此时具有最高的分离效率。但对于在线二维色谱系统来说，NPLC×RPLC模式最大的缺陷是存在流动相不兼容的问题。尽管目前已有在线蒸发接口技术解决了这一问题[26]，但操作复杂，尤其是对于常规分析来说不具有普遍性和实用性。因此本研究在一维和二维分离中均采用疏水保留机理的反相色谱分离模式，一维选择C8柱，二维选择C18柱。C8柱的脂溶性保留能力比C18柱弱，由于一维为初步分离，选择C8柱，脂溶性物质可以更快的流出，同时为了缩短分析时间，使甲基睾酮组分更快的流出，C8柱的长度选择150 mm。二维的分离要确保目标物和杂质的完全分离，因此选择对非极性和弱极性化合物分离能力更强的C18柱，色谱柱长度选择250 mm。

2.2 中心切割时间的确定

中心切割技术是将感兴趣的第一维组分转移到第二维上，以便进行进一步的分析。因此中心切割时间的选择在二维色谱方法中至关重要，首先要根据一维色谱中甲基睾酮的保留时间来确定。在上述一维色谱条件下，通过标准溶液进样(流速为1.0 mL/min)，确定甲基睾酮的保留时间为7.35 min，峰宽约为0.7 min，因此甲基睾酮色谱峰从峰起始到峰结束的时间段为7.00～7.70 min。除此之外，还要计算甲基睾酮从一维紫外检测器流出到进入捕集柱的时间。根据连接的不锈钢管路的内径和长度，确定这段管路的体积约为300 μL。因此，得到目标物从紫外检测器到捕集柱的时间约为0.3 min。因此甲基睾酮色谱峰到达捕集柱的时间段为7.30～8.00 min。因此中心切割时间至少要全部包括7.30～8.00 min这一时间段。同时考虑到整体色谱系统的稳定性以及样品基质对目标物的影响，保留时间往往也会发生一定范围的偏差。中心切割时间过窄，目标物会有损失，这将影响到二维色谱的灵敏度和检测结果的准确性；中心切割时间过宽，会造成较多的基质干扰物进入二维色谱柱，影响二维色谱的分离，同时也会缩短捕集柱的寿命。因此最终的中心切割时间设为7.00～8.40 min。

2.3 稀释泵流速的确定

稀释泵所用的流动相为超纯水，其主要作用是迅速降低捕集柱中有机相的比例，从而保证在中心切割时间内目标物保留在捕集柱上，同时还具有溶质聚焦作用，防止进入第二维的色谱峰展宽造成灵敏度降低。能否将目标物保留在捕集柱上，是决定二维色谱分析方法成败的关键。通过对稀释泵设置一系列流速，其余参数按照1.3的仪器条件进行设置，用400 μg/L的甲基睾酮标准溶液进样，记录二维和一维甲基睾酮色谱峰的面积，计算两者比值，从而确定捕集柱对甲基睾酮的保留情况，结果如表1所示。当流速为3 mL/min时，仅有48.2%的甲基睾酮被捕集柱捕获；当流速为4 mL/min时，有75.1%的甲基睾酮可被捕集柱捕获；当流速为5 mL/min时，有93.3%的甲基睾酮可被捕集柱捕获；再进一步提高流速，保留在捕集柱上的甲基睾酮无明显变化。流速越大，捕集柱中的水的含量越大，有机相的比例越小，捕集柱的寿命就会降低。此外，稀释泵流速越大，二维系统的压力也会越高。综合考虑，稀释泵流速选择5 mL/min比较合适。

表1 稀释泵流速与捕集柱的捕集效果
Tab.1 The relationship between flow rate of dilution pump and trapping effect of trap column

稀释泵流速/(mL·min-1)Flowrateofdilutionpump二维与一维色谱峰面积比值/%Ratioofthepeakareaofthesec⁃onddimensionalandthefirstdi⁃mensional348．2475．1593．3693．5894．1

2.4 二维色谱系统稳定性考察

由于二维液相色谱峰的响应信号不是通过直接进样产生的，而是通过一维进样、捕集柱捕集后转移到二维色谱产生的。这是与常规色谱通过直接进样产生色谱响应信号明显的不同之处。此外，二维色谱响应信号还受到中心切割时间窗口选择的适宜性、捕集柱的捕集能力、目标物在捕集柱上洗脱的难易程度以及阀切换导致的系统压力突变等多种因素的影响，因此需要对构建的二维色谱系统的稳定性进行考察。

将50 μg/L甲基睾酮标准溶液连续进样6次，记录甲基睾酮二维色谱峰的保留时间和峰面积，结果如表2所示。计算得到保留时间的相对标准偏差(RSD)为0.07%，峰面积的RSD为1.56%，完全满足JJG 705—2014《液相色谱仪检定规程》中定性重复性≤1.0%和定量重复性≤3.0%的要求。

由此可见，构建的二维液相色谱系统稳定性良好，和常规液相色谱相比，无显著差异。

表2 甲基睾酮标样的保留时间和峰面积
Tab.2 Retention time and peak area of MET

保留时间/minRetentiontime峰面积Peakarea19．951386719．977384219．979376319．971374419．943388919．9633861

2.5 方法学验证

2.5.1 线性关系和检出限

将质量浓度分别为50、100、200、400、1 000 μg/L甲基睾酮标准溶液依次进样检测。以质量浓度为横坐标，以甲基睾酮的二维色谱峰面积为纵坐标，做线性回归，得到曲线方程为Y=74.904 4X+140.544，相关系数R2为0.999 6，线性关系良好。向鳗鲡阴性样品中添加一定量甲基睾酮标液，使甲基睾酮含量为10 μg/kg，混匀，然后按本研究方法进行样品处理和检测，计算信噪比S/N=4.3，检出限约为7 μg/kg，满足国家对水产品中甲基睾酮不得检出(即甲基睾酮残留量小于10 μg/kg)的管理要求。

2.5.2 准确度和精确度

向鳗鲡阴性样品中添加3个浓度水平的甲基睾酮，每个浓度水平6个平行样品。按本研究方法进行检测。结果如表3所示。在添加含量10～100 μg/kg范围内，平均回收率为87.8%～93.2%，相对标准偏差为4.75%～7.31%。

表3 加标样品的回收率和精密度
Tab.3 Recovery and RSD of spiked samples

添加含量/(μg·kg-1)Spikedconcentration平均回收率/%Averagerecovery相对标准偏差/%RSD1093．27．315088．55．4610087．84．75

2.6 常规液相和二维液相色谱检测结果比较

鳗鲡样品经处理后分别用常规液相和二维液相上机检测。尽管大部分样品都可用常规液相色谱进行检测，但也存在个别样品由于较强的基质干扰难以对结果进行准确判定的情况。图4为存在基质干扰的鳗鲡阴性样品和甲基睾酮标样的常规液相色谱图，其中，甲基睾酮标样质量浓度为400 μg/L，样品由于在甲基睾酮出峰处存在较大的干扰，导致无法准确地进行定性和定量判定。对该样品用二维液相色谱检测，结果如图5所示，样品在甲基睾酮出峰处基线平稳，不再有杂质峰的干扰。此时，可以准确地判断出样品中不含有甲基睾酮。对这类阴性样品进行加标，然后按本研究方法进行检测，二维液相色谱图如图6所示，甲基睾酮色谱峰和杂质峰分离完全，可以准确地计算出样品中甲基睾酮的含量。

图4 鳗鲡阴性样品和MET标样的常规液相色谱图Fig.4 Liquid chromatography of eel negative sample and MET standard sample

图5 鳗鲡阴性样品和MET标样的二维液相色谱图Fig.5 Two-dimensional liquid chromatography of eel negative sample and MET standard sample

图6 鳗鲡阴性加标样品的二维液相色谱图Fig.6 Two-dimensional liquid chromatography of spiked eel sample

2.7 实际样品检测

对采自福建省福清市和长乐市相关养殖基地的28批次日本鳗鲡样品，按照本研究方法进行处理和检测，结果均为阴性。同时将上述样品按照SC/T 3029—2006的液相色谱法进行检测，其中21个批次的样品结果为阴性，剩余 7个批次的样品在甲基睾酮出峰处出现一定的干扰，无法对结果进行准确判定。为此，对出现干扰的样品用液相色谱-串联质谱法[15]进一步确证，结果显示均为阴性。实验结果表明，上述样品均为阴性样品，与本研究方法检测结果一致，也进一步说明本研究方法较为准确可靠。

3 结论

鳗鲡中含有较多的脂肪成分，在用常规液相色谱进行甲基睾酮检测时，经常会出现干扰，影响了对检测结果的判定。针对这一状况，本研究基于二维色谱的分离技术，在构建二维液相色谱系统的基础上，建立了鳗鲡中甲基睾酮的在线二维液相色谱分析方法，实现了甲基睾酮与基质干扰物的有效分离，提高了检测结果的准确性，具有一定的实际应用推广价值。

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Study on determination of methyltestosterone in eel bytwo-dimensional liquid chromatography

NIU Yuehua, CHEN Geng, HUANG Dongren, ZOU Hongmei, KANG Jianping, ZHANG Tianwen*

(Fujian Marine Environment and Fishery Resources Monitoring Center, Fuzhou 350003, China)

Eel products have high fat content. Since the conventional liquid chromatography would easily lead to interference in the analysis, it is necessary to establish on-line two-dimensional liquid chromatography inspection method for determination of methyltestosterone in eel products. Samples were extracted with ether and purified by silica gel solid phase extraction column, and then determined by two-dimensional liquid chromatography. C8and C18columns were selected as the first and second dimensional chromatographic columns to construct the two-dimensional separation system. The target fraction of the first-dimensional column was transferred to the second-dimensional column for further separation through heart-cutting technique. The results showed that the two-dimensional liquid chromatographic system had good stability, and the established method can realize the full separation of methyltestosterone and matrix interference. The method was accurate and reliable, and suitable for the determination of methyltestosterone in eel products. This study solved the interference problem which often appears in the determination of methyltestosterone residues in eel products with high fat by conventional liquid chromatography, and was a useful supplement to existing liquid chromatography method for determination of methyltestosterone residues in aquatic products. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(2):38-44]

eel; methyltestosterone; two-dimensional liquid chromatography; heart-cutting

ZHANG Tianwen, zhangtw1986@163.com

2015-09-01；接收日期：2015-12-11

福建省社会发展重点项目(2012Y0005)

牛曰华(1981-)，男，工程师，研究方向为水产品中药物残留分析，292798330@qq.com

：张天闻，工程师，研究方向为水产品中药物残留分析，zhangtw1986@163.com

S94；O657.7

：A

：2095-1833(2016)02-0038-07