加味宫外孕Ⅱ号方对早孕大鼠滋养细胞及肝脏的影响

郑文兰 杨江燕 文晓敏 陈欢欢

(1.贵阳中医学院第一附属医院，贵州 贵阳 550002；2.绥阳县中医院， 贵州 绥阳 563300)



加味宫外孕Ⅱ号方对早孕大鼠滋养细胞及肝脏的影响

郑文兰1杨江燕2文晓敏1陈欢欢1

(1.贵阳中医学院第一附属医院，贵州 贵阳 550002；2.绥阳县中医院， 贵州 绥阳 563300)

目的 观察加味宫外孕Ⅱ号方对早孕大鼠滋养细胞及肝脏的影响。方法 将早孕大鼠分为西药组(甲氨蝶呤)、中药(加味宫外孕Ⅱ号方)低、中、高剂量组、中西药结合组和空白组(生理盐水)，分别予甲氨蝶呤肌注、中药或生理盐水灌胃，第8天处死孕鼠取血、肝脏、子宫及孕囊，检测血β-HCG,观察滋养细胞及肝脏组织病理学改变。结果 与空白组比较，另5组出现滋养细胞结构异常、破坏，线粒体肿胀，核异染色质增多，炎细胞浸润及血β-HCG下降，以中药高剂量组和中西药结合组较明显，与其他3组比较差异有统计学意义(P<0.05)，中药中剂量与低剂量组比较差异有统计学意义。除中药低剂量组外，另外几组孕鼠肝脏病理学评分上升，与空白组比较差异有统计学意义，西药组和中西药结合组上升明显，与中药高、中剂量组比较差异有统计学意义。结论 加味宫外孕Ⅱ号方通过影响孕鼠滋养细胞形态结构及功能而达到损坏胚胎目的，且存在量效关系，剂量增高作用增强；而对孕鼠肝损害较甲氨蝶呤轻。

加味宫外孕Ⅱ号方 早孕大鼠 滋养细胞 肝损害

异位妊娠(EP)是妇科常见的急腹症，是孕产妇死亡的原因之一，发病率约2 %，病死率占孕妇死亡总数的9 %～10 %[1-2]，严重威胁育龄期妇女的生命安全及生殖功能。本院自2000年开始EP的药物保守治疗，经临床实践，筛选出一个相对稳定的中药协定处方即加味宫外孕Ⅱ号方，其保守治疗成功率86.7%[3]，广泛应用于临床17年，但其杀胚作用机理及对肝脏的影响尚不清楚。而输卵管妊娠目前仍未能建立EP动物模型，故本研究以早孕大鼠为模型，探索该方对妊娠滋养叶细胞及肝脏的影响，以进一步探讨其作用机制及副作用，间接为中医药保守治疗EP提供科学的实验依据。

1 资料与方法

1.1 动物

SPF级SD大鼠共110只，其中性成熟未生育雌性大鼠80只，体质量(260±10) g；性成熟雄性大鼠30只，体质量(280±10) g。由第三军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK-(渝)2012-0005。

1.2 药物与试剂

加味宫外孕Ⅱ号方组成：丹参15 g、桃仁9 g、赤芍15 g、莪术9 g、三棱 9 g、全蝎10 g、土鳖虫10 g、蜈蚣9 g、紫草25 g，以上中药购于贵州省中医院，由贵阳中医学院制剂室制备成浓度为每毫升含生药6 g(高剂量)、3 g(中剂量)、1.5 g(低剂量)的3种药液，分别装瓶标记，置于4 ℃冰箱冷藏备用；甲氨喋呤(MTX)由山西普德药业有限公司生产，批号H14022462；HCG(绒毛膜促性腺激素)试剂盒由云南诺贝生物科技有限公司生产。

1.3 动物模型制备

造模方法参照《药理实验方法学》[4]：取雌鼠阴道分泌物作脱落细胞检查，观察2周，剔除无动情周期雌鼠16只，将雄鼠与动情期的雌鼠按1∶1比例合笼，次晨取雌鼠阴道分泌物镜检，查见精子为妊娠第1天。

1.4 动物分组与给药

将交配成功的孕鼠随机编号分为6组(每组8只)：西药组、中西药结合组和中药低、中、高剂量组、空白组。经计算每只大鼠加味宫外孕Ⅱ号方给药容积为0.777 mL/(100 g·d)，MTX给药剂量为0.777 5 mg/100 g。给药时间为上午09：00-10：00。

西药组：妊娠第1天按0.777 5 mg/100 g体质量肌注MTX，1次为1个疗程，以后不再给药，并同时按0.777 mL/100 g体质量予生理盐水灌胃，1次/d。中药高、中、低剂量组：妊娠第1天起按0.777 mL/100 g体质量分别给予高、中、低剂量的加味宫外孕Ⅱ号方灌胃，1次/d。中西药结合组：妊娠第1天起予中剂量加味宫外孕Ⅱ号方灌胃及MTX肌注。方法同西药组及中药组。空白组：妊娠第1天起按0.777 mL/100 g体质量予0.9%生理盐水灌胃，1次/d。中药及生理盐水灌胃均连续用7 d。

1.5 标本收集与指标检测

1.5.1 标本收集 用药后第7天晚8点开始禁饮食，次晨8：00处死大鼠。同时取股动脉血5 mL，室温下静置1 h，以3 000r/min离心15 min，收集血清置-80 ℃冰箱备用。迅速取出大鼠肝脏及部分妊娠子宫,用4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋HE染色作光镜检查用。将另一部分妊娠子宫切成大小为1 mm×1 mm的组织块，放入2.5%戊二醛溶液中，固定24 h制片作电镜检查用。

1.5.2 检测大鼠血β-HCG值 从冰箱中取出备用的血清并在室温下解冻。采用ELISA法按HCG试剂盒说明书的方法测定孕鼠血清的HCG值。

1.5.3 孕鼠肝脏组织病理学检查 肝脏组织病理学分级标准及评分参照文献[5] 拟定：(1)肝细胞脂肪变性:包括大泡性脂变和小泡性脂变，无(-)；散在(+)；片状病变<33%或限于肝腺泡Ⅲ区(++)；片状病变33%～66%或达到肝腺泡Ⅱ区(+++)；弥漫性病变>66%或达到肝腺泡Ⅰ区(++++)。(2)肝小叶内炎症、坏死：无(-)；散在小坏死灶(+)；片状坏死灶(++)；大坏死灶，弥漫存在于肝小叶(+++)；桥接坏死(++++)。(3)纤维化：中央静脉或汇管区周围轻度纤维化(Ⅰ级)；中央静脉间有纤维隔形成，但尚未连接成环(Ⅱ级)；中央静脉间纤维隔相连成环形，汇管区位于其中央(Ⅲ级)；中央静脉间纤维隔相连成环形，汇管区位于其中央，并且在中央静脉和汇管区之间出现纤维隔(Ⅳ级)；病理评分标准:(-)记0分； (+、Ⅰ级)各记1分；(++、Ⅱ级)各记2分；(+++、Ⅲ级)各记3分；(++++、Ⅳ级)各记4分。以上3项合计为总评分。

1.5.4 滋养细胞及孕囊组织病理学评分标准 评分标准参照文献[6] 拟定：0 分,胚囊及滋养细胞正常形态完全消失，无或少量坏死组织残留； 1分,滋养细胞数量大量减少(90%)，部分胚囊及坏死组织残留； 2分,滋养细胞数量减少(60%)，大量炎性细胞浸润，胚囊正常形态破坏； 3分,滋养细胞数量减少(30%)，少量炎性细胞浸润，胚囊完整； 4分,滋养细胞发育良好，胚囊完整。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 孕鼠肝脏组织病理学改变

甲氨蝶呤及中药加味宫外孕Ⅱ号方均可使孕鼠肝脏出现不同程度的肝细胞水肿，脂肪空泡分布，汇管区、小叶中央静脉和间质见炎细胞浸润，纤维结缔组织增生，肝脏组织病理学评分见表1。低剂量组与空白组、中剂量组与高剂量组、西药组与中西药结合组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

组别孕鼠数肝脏组织病理学评分分布/只0136912总评分空白组88000000.00±0西药组80033116.00±3.2*■△中西药结合组80034105.25±2.1*■□△中药中剂量组81322002.63±2.3*▲△○中药高剂量组80232104.00±2.8*▲△○中药低剂量组86110000.50±1.7

注：与空白组比较，*P<0.05；与中剂量组比较，■P<0.05；与高剂量组比较，□P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05；与西药组比较，▲P<0.05；与结合组比较，○P<0.05。

2.2 6组孕鼠血β-HCG变化

6组孕鼠的血β-HCG见表2，西药组与中药中剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

组别动物数/只β-HCG/(mIU/mL)空白组西药组88 16.6±3.639.08±3.27*○□△中西药结合组8 3.86±1.72*▲■□△中药中剂量组8 8.55±4.10*□△○中药高剂量组中药低剂量组88 6.72±2.45*△▲○■ 11.47±4.29*▲○■□

注：与空白组比较，*P<0.05;与中剂量组比较，■P<0.05;与高剂量组比较，□P<0.05;与低剂量组比较，△P<0.05;与西药组比较，▲P<0.05;与结合组比较,○P<0.05。

2.3 6组孕鼠妊娠滋养细胞病理评分

空白组滋养细胞形态正常，细胞排列整齐、体积正常、可见完整的胚囊组织；其他5组均出现不同程度的滋养细胞数量减少，结构不清、体积变小，炎细胞浸润，胚囊的正常组织结构被破坏或消失，坏死组织残留。见图1。滋养细胞组织病理学评分西药组和中药中、低剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，中西药结合组和中药高剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

图1 各组孕鼠妊娠滋养细胞组织病理学改变

组别孕鼠数滋养叶细胞病理评分分布01234评分空白组8000084.00±0西药组中西药结合组8815222120102.001±1.3*○□0.50±0.8*■△▲中药中剂量组8221121.88±1.6*□○中药高剂量组中药低剂量组8830312302020.88±0.8*△■▲2.50±0.9*□○

注：与空白组比较，*P<0.05；与中剂量组比较，■P<0.05；与高剂量组比较，□P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05；与西药组比较，▲P<0.05；与结合组比较，○P<0.05。

2.4 6组孕鼠滋养细胞超微结构观察

空白组：核仁呈圆形，核膜界限清楚，核质内染色质均匀，胞浆内布满正常细胞器；西药组：细胞核无明显异常，异染色质边集于细胞膜，部分线粒体空泡化；结合组：细胞与细胞之间的间隙明显较正常宽，可见不规则细胞核形状，细胞核内布满颜色较深的异染色质，并边集于细胞膜，胞浆内细胞器较正常少，可见空泡化线粒体；中药中剂量组：细胞核形状较不规则，异染色质增多，线粒体肿胀；低剂量组：细胞核正常，线粒体肿胀；高剂量组：整个细胞肿胀，胞浆稀疏，线粒体肿胀，脊断裂或消失。

3 讨 论

中医认为异位妊娠本质是血瘀少腹，其治则为活血杀胚消癥，本院所用加味宫外孕Ⅰ号方是在宫外孕Ⅱ号方(丹参、赤芍、桃仁、三棱、莪术)的基础上加蜈蚣、全蝎、土鳖虫、紫草等。原方中丹参、赤芍、桃仁、三棱、莪术具活血化瘀消癥之功，而蜈蚣、全蝎、土鳖虫、紫草有破血、杀胚的作用,全方共奏活血杀胚消癥之效。MTX能干扰DNA、RNA及蛋白质合成和胚胎滋养细胞分裂,使胎盘、绒毛变性坏死、胚胎死亡，既往研究[7]认为甲氨蝶呤或中药加味宫外孕Ⅱ号方均具有杀胚作用，但两者合用杀胚效果更好[8]。屈云飞等[9]用MTX治疗异位妊娠，肝毒性发生率为6.81%。从本研究结果看，滋养叶细胞的变化及血β-HCG下降在中西医结合组及中药高剂量组更明显，提示当中药剂量加大时杀胚作用增强，且能达到与中西药结合组相似的效果。多年来，甲氨蝶呤广泛用于治疗异位妊娠，但治疗后是否会增加下次妊娠胚胎的畸形或造成不良妊娠结局也是值得临床医师关注的问题。孙闻嘉等[10]研究发现甲氨蝶呤应用后广泛分布于母体组织，在肝脏可持续蓄积达4个月之久，因此，在计划妊娠前应停止使用甲氨蝶呤≥4 个月。本研究也发现甲氨蝶呤和中药虽可造成孕鼠肝细胞水肿，脂肪空泡分布，汇管区、小叶中央静脉和间质见炎性细胞浸润，纤维结缔组织增生；而中药影响较轻。综上所述，加味宫外孕Ⅱ号方可使孕鼠滋养叶细胞正常形态结构破坏，β-HCG分泌减少，妊娠不能维持，加之局部炎性细胞浸润，导致胚胎组织发育停止并消亡。且随剂量增加作用逐渐增强，但对肝脏的损害较西药小。因此，在今后临床中，对异位妊娠药物保守治疗的患者，为避免常规用甲氨蝶呤的副作用，我们是否可以首选中药治疗，并适当增加中药的剂量。由于本研究所用模型为宫内妊娠的大鼠，结果存在一定的局限性，还需临床大样本、前瞻性、随机队列的进一步研究。

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[3] 郑文兰，赵芳.米非司酮联合中药治疗异位妊娠30例[J].四川中医,2005,23(8):83.

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读者·作者·编者

医学出版物中有效数字的确定

有效数字是指在实际测量中所能得到的有意义的数字。一个由有效数字构成的数值，只有末位数是估计数字，其余各位数字都必须是准确的。有效数字与测量仪器的灵敏度有关。以天平称重为例，如果天平的灵敏度为0.1 mg,那么称重结果16.14 mg为准确数字，0.04 mg为估计数字，两项合在一起组成有效数字。平均值±标准差的位数，除了取决于测量仪器的精密度外，还取决于样本内个体的变异，一般按标准差的三分之一来确定。如：(4.61±0.42)kg，标准差的三分之一为0.14，标准差波动在百克位，即小数点后第1位上，故应取到小数点后第一位，即(3.6±0.4)，过多的位数并无意义。但是在一系列数值并列时，小数点后的位数应一致。如在(3.61±0.42)、(5.86±0.73)、(2.34±0.15)这样一组数据中，第3组数据标准差0.15的三分之一为0.05，在小数点后第2位，则该组数据的有效位数可均取到第2位。

贵州医药杂志社

Influence of trophoblast and liver of pregnancy rats with Chinese medicine which called the modified decoction Ⅱfor ectopic pregnancy.

ZhengWenlan1,YangJiangyan2,WenXiaomin1,ChenHuanhuan1.

1.TheFirstAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550001，Guizhou,China. 2.SuiyangCountyHospital,Suiyang563300,Guizhou,China.

Objective To observe the influence of trophoblast cell and liver of pregnancy rats with the modified decoction Ⅱfor ectopic pregnancy. Methods The building successful pregnancy rats were randomly divided into the western medicine group (treat by methotrexate), the Chinese medicine group(The modified decoction Ⅱ for ectopic pregnancy low, medium, high dose), the combination of Chinese and western medicine group (treat by methotrexate and Party), and the blank group (saline).These groups were given an intramuscular injection with MTX, Party or saline was gavage once a day, for 7 days. On the eighth day of drug delivery, the rats were killed and taken the femoral arterial blood, livers, gravid uterus and gestational sacs, and measured the value of blood β-HCG, then observed the pathology change of trophoblast cells and liver tissue. Results Compared with the blank group, the other five treatment groups of trophoblast cells structure were damaged to varying degrees, mitochondria swelling, nucleus heterochromatin increased, inflammatory cells infiltration, the structure of embryo abnormalities and reduced blood β-HCG value. The changes in TCM high dose group and the combination of Chinese and western medicine group were more apparent. There were differences in comparison with the other three treatment groups(P<0.05). And there were differences in comparison with the TCM medium dose group and the low dose group. In addition to TCM low dose group, the other groups of pregnant rats liver pathology score rise, there were statistical significantly differences compared with the blank group. The score of western medicine group and the combination of Chinese and western medicine group increased significantly, which were differences compared with the TCM high and medium dose group.Conclusion Modified decoction Ⅱ for ectopic pregnancy destructed trophoblast morphological structure, reducing the amount of sertoli cell, normal physiological function damaged and achieve the goal of killing embryos. There is concentration-response relationship, dose, the higher the better, killing the embryos stronger, and traditional Chinese medicine (TCM)on pregnance rat liver damage is lighter than methotrexate.

The modified decoction Ⅱfor ectopic pregnancy； Pregnancy rats；Trophoblast; Liver damage

贵州省科技厅联合基金[黔科合中药字(2011)LKZ7041]

R714.22

A

1000-744X(2016)10-1032-04

2016-05-30)