酪蛋白磷酸肽-钙络合物对酸乳发酵特性及微观结构的影响

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083)

酪蛋白磷酸肽-钙络合物对酸乳发酵特性及微观结构的影响

刘泽朋，祝缘，王婷婷，赵丽丽，毛学英

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083)

本文旨在探究酪蛋白磷酸肽-钙络合物（CPP-Ca）对酸乳发酵特性和微观结构的影响。研究不同添加量CPP-Ca络合物对酸乳发酵过程中pH值、滴定酸度、乳酸菌数以及酸乳微观结构和乳清析出率的影响。结果表明，CPP-Ca络合物的添加可以降低酸乳发酵过程中的pH值，提高滴定酸度；对酸乳发酵过程中的乳酸菌总数没有显著影响；增大酸乳蛋白网络孔径，提高凝胶结构的连续性和均一性，降低酸乳乳清析出率。

酪蛋白磷酸肽-钙络合物；酸乳；发酵特性；乳清析出

0 引言

钙质缺乏是全球性的营养问题，人们一直在寻找吸收率高的补钙制剂。传统的无机钙盐和有机钙盐由于难吸收，毒副作用大被逐渐淘汰。作为新型钙营养补充剂，多肽钙可以被动物体内独立的小肽转运系统以较快的速度吸收[1]；大大提高钙的吸收利用率[2]；且无毒副作用，是较为理想的钙制剂[3-4]。

酪蛋白磷酸肽（CPP）是来源于牛乳酪蛋白的多肽，具有良好的促钙吸收效果[5]。研究发现CPP可以提高成骨细胞对钙的吸收[6]，与钙离子形成螯合物促进钙以稳定形式被细胞吸收[7]。

多肽可以为乳酸菌生长提供氮源，酪蛋白磷酸肽-钙络合物（CPP-Ca）既有助于酸乳发酵，又能够起到钙营养强化的作用。本文研究了CPP-Ca对酸乳发酵及产品特性的影响，为其在酸乳中的应用提供理论基础。

1 实验

1.1材料与仪器

1.1.1 实验材料

脱脂乳粉，直投式发酵剂YF-L812，CPP-Ca（实验室制备）。

普通化学试剂：氢氧化钠、邻苯酸氢二钾、酚酞、EDTA二钠、氯化铵、铬黑T、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、吐温80、无水乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、一水合硫酸锰、柠檬酸氢二胺、Cys-HCl、琼脂、氯化钠等

1.1.2 仪器

恒温水浴锅（PK-8B），恒温水浴振荡器（DSHZ-300A），立式压力蒸汽灭菌器（BXM-30R），洁净工作台（BBS-SDC），漩涡振荡器（QL-860），磁力搅拌器（78HW-1），pH计（FE20），电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9076A），激光共聚焦扫描显微镜（LSM710）。

1.2实验方法

1.2.1 酸乳的制作

将CPP-Ca以0，0.5，1，1.5 g/L的质量浓度添加于脱脂乳粉中，混合搅拌均匀，4℃冷藏过夜充分水合。脱脂乳经95℃杀菌5 min后，冷却至42～43℃，接种1%的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混合菌种，在42℃培养箱中发酵至pH值至4.6时到达发酵终点。

1.2.2 pH值的测定

将pH探头清洗干净后小心浸入样品中，使pH计探头完全浸没，待读数稳定后读取样品pH值。

1.2.3 滴定酸度的测定

称取2 g（精确到0.01 g）已混匀的试样，置于150 mL锥形瓶中，加20 mL新煮沸冷却至室温的水，混匀。于溶解混匀后的试样中加入2.0 mL酚酞指示液，混匀后用氢氧化钠标准溶液滴定至微红色，并在30 s内不褪色，记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数，代入公式进行计算：

式中：X为试样的酸度（°T）；C为氢氧化钠标准溶液的浓度（moL/L）；V为滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，单位为毫升（mL）；m为试样的质量（g）；0.1为酸度理论定义氢氧化钠的浓度（mol/L）。

1.2.4 酸乳微观结构的测定

将CPP-Ca络合物以0，0.5，1，1.5 g/L的质量浓度添加于脱脂乳中，混合搅拌均匀，水合过夜。经95℃杀菌5 min后，冷却至42～43℃。然后，按Lucey报道的方法制作酸乳激光共聚焦样品[8]，在杀菌冷却后的乳中加入罗丹明B作为荧光蛋白染料，使染料在乳中的最终质量浓度为0.1 mg/mL。添加质量浓度1 g/L发酵剂于乳中并搅拌均匀。取适量样品（约100 μL）于载玻片凹槽内，盖上盖玻片并用硅油密封，发酵至pH值为4.6时结束发酵，置于4℃冷藏。使用Zeiss780倒置共聚焦显微镜对酸乳凝胶的微观结构进行观察，用Ar/Kr激光束激发出488 nm的波长，在100倍油镜下观察不同视野酸乳凝胶的微观结构。

1.2.5 乳酸菌计数

酸乳样品以适当比例稀释后接种于MRS培养基中，37℃培养48 h后进行菌落计数。选择菌落数30～ 300的平板进行计数，结果以CFU/mL表示。

1.2.6 黏度的测定

取酸乳样品约8 mL置于10 mL离心管中，发酵完成后使用J-5S型数字式黏度计测定酸乳黏度。

1.2.7 乳清析出的测定

取约10 g酸乳样品，在4℃下，采用100 g离心力离心10 min，结束后小心吸出上清液，称重。按照下述公式计算酸乳乳清析出。

式中：m1为离心前样品与空管的质量（g）；m0为离心去掉上清液后样品与空管的质量（g）；m2为酸乳样品的质量（g）。

2 结果与分析

2.1 CPP-Ca对酸乳发酵过程中pH值和滴定酸度的影响

不同添加量的CPP-Ca络合物对酸乳发酵过程中pH值和滴定酸度的影响分别如图1和图2所示。发酵过程中酸乳的pH值随着CPP-Ca添加量的增加而下降，滴定酸度随CPP-Ca添加量的增加而升高。当CPP-Ca添加量为1.5 g/L时，酸乳发酵过程中的滴定酸度和pH值分别显著高于和低于其他样品。说明CPP-Ca具有促进乳酸菌产酸，降低发酵过程pH值，缩短发酵时间的作用。此外，CPP-Ca对酸乳滴定酸度的影响是在2 h后才出现显著性差异，说明CPP-Ca对酸度的影响存在滞后现象。随发酵过程的进行，CPP-Ca可能发生了解离，释放出游离的钙离子。体系中随Ca2+的增加会提高氢离子浓度，降低pH值[9]。因此，在发酵2 h后，酸奶的滴定酸度随CPP-Ca浓度的增加开始呈现显著性的提高。

另外，由于牛奶本身含很少量的非蛋白态氮，且嗜热链球菌的蛋白水解能力很弱，因此通过添加酪蛋白水解物CPP增加了发酵体系中肽和游离氨基酸的含量，从而增强了嗜热链球菌的生长和产酸能力[10]。同时由于微生物之间的益生作用球菌的生长过程中产生对保加利亚乳杆菌有益的促生长因子，也有利于嗜热链球菌的生长和产酸。

图1 CPP-Ca的添加对酸乳发酵过程中pH值的影响

图2 CPP-Ca的添加对酸乳发酵过程中滴定酸度的影响

2.2 CPP-Ca络合物对酸乳发酵过程中乳酸菌数的影响

不同添加量的CPP-Ca对酸乳发酵过程中乳酸菌数的影响如图3所示。由图3可以看出，随着发酵时间的延长，添加不同剂量CPP-Ca的样品乳酸菌数变化趋势同对照组一致，均呈上升趋势。发酵至4 h，对照组、CPP-Ca添加量为0.5 g/L、1 g/L的样品乳酸菌数稍有下降，但与其他样品组之间无显著性差异。并且当发酵结束后，各样品的乳酸菌数也无明显差异，说明CPP-Ca的添加对酸乳发酵过程中的乳酸菌数没有显著影响。而CPP作为酪蛋白水解后的多肽混合物，理论上能为微生物的生长提供氮源，具有促发酵作用[11,12]。但在发酵过程中球菌和杆菌数量比却可能发生了变化。CPP-Ca浓度的增加，可能促进某一菌株的增加，而抑制了另外一菌株的生长。Oliveira等人[13]研究表明，酪蛋白水解物对不同益生菌菌株的稳定性是不同的。在发酵初期蛋白水解物可能对于水解能力有限的球菌有明显促生长作用，而对杆菌活菌数没有显著的变化。到发酵后期，由于酸度的增加，对酸性更敏感的球菌则可能减少，而杆菌活菌数则上升。

图3 CPP-Ca的添加对酸乳发酵过程中乳酸菌数的影响

2.3 CPP-Ca络合物对酸乳微观结构的影响

不同添加量的CPP-Ca络合物对酸乳微观结构的影响如图4所示。图4中，A、B、C、D分别代表CPP-Ca添加量为0，0.5，1，1.5 g/L的酸乳样品。结果显示，未添加CPP-Ca络合物时，酸乳蛋白质交联程度致密，网络孔隙小，且不连续。随CPP-Ca添加量的增加，酸乳蛋白凝胶网络结构呈现网络孔隙增大，致密性降低，但连续性和均一性增强。当添加量为1.5 g/L，凝胶网络孔隙最大，连续性和均一性最佳。孔隙的增大利于对乳清进行包裹，防止乳清过度析出。体系中钙的增加有利于与胶体磷酸根离子结合，形成胶体磷酸钙，进而可以增加酪蛋白之间的交联作用[14]，同时，CPP质量浓度的增加也可以与乳清蛋白形成交联，减少了乳清蛋白和酪蛋白之间交联形成的致密结构。

图4 CPP-Ca的添加对酸乳微观结构的影响

2.4 CPP-Ca络合物对酸乳乳清析出的影响

不同添加量CPP-Ca络合物对酸乳乳清析出的影响如图5所示。由图5可以看出，随着CPP-Ca络合物浓度的增加，发酵乳乳清析出率显著降低。当CPP-Ca络合物添加量为1.5 g/L时，乳清析出率最少。

图5 CPP-Ca的添加对酸乳乳清析出率的影响

体系中钙质量浓度的增加，可以增加胶体磷酸钙的形成并与酪蛋白胶束结合，形成连续性较强的胶体网络结构，提高胶体持水力[9]。因此，CPP-Ca可以提高酸奶中可溶性钙质量浓度，使胶体网络结构连续均一，抑制了乳清析出。但体系中钙的存在形式也会影响酸乳凝胶特性。Ramasubramanian等人[9]比较了离子钙和非离子钙对酸乳黏度和硬度的影响，发现游离钙一定程度会降低酸乳质构特性，而非游离钙则会在一定程度改善酸乳质构特性。

3 结论

（1）在酸乳发酵过程中，CPP-Ca具有促进酸乳发酵的作用，在相同发酵时间内可以促进乳酸菌产酸，降低pH值，增加滴定酸度。

（2）在酸乳发酵过程中，CPP-Ca的添加对乳酸菌数的变化没有显著影响，但可能会影响其比例。

（3）CPP-Ca的添加会增大凝胶结构的孔径，形成连续性和均一性较强的网络结构，进而降低了酸乳的乳清析出率。

[1]TSURUKI T,YOSHIKAWA M.Anti-alopecia effect of Gly-Leu-Phe, an immunostimulating peptide derived from α-lactalbumin[J].Biosci⁃ence,biotechnology,and biochemistry,2005,69(8):1633-1635.

[2]方细娟,曾庆祝,战宇,等.多肽-金属元素配合物的研究进展及发展前景[J].食品工业科技,2012,33(4):413-416.

[3]陈华,钟红茂,范洁伟,等.国内补钙产品的研究现状[J].现代食品与药品杂志,2007,17(6):57-59.

[4]韩樱,何慧,赵宁宁,等.蛋清肽-钙配合物体内促钙吸收作用研究[J].食品科学,2012,33(11):262-265.

[5]REEVES R E,LATOUR N G.Calcium phosphate sequestering phos⁃phopeptide from casein[J].Science,1958,128(3322):472-472.

[6]DONIDA B M,MRAK E,GRAVAGHI C,et al.Casein phospho⁃peptides promote calcium uptake and modulate the differentiation pathway in human primary osteoblast-like cells[J].Peptides,2009,30 (12):2233-2241.

[7]COSENTINO S,DONIDA B M,MARASCO E,et al.Calcium ions enclosed in casein phosphopeptide aggregatesare directly involved in the mineral uptake by differentiated HT-29 cells[J].International dairy journal,2010,20(11):770-776.

[8]LUCEY J A,TEO C T,MUNRO P A,et al.Microstructure,permea⁃bility and appearance of acid gels made from heated skim milk[J].Food Hydrocolloid,1998a,12(2):159-165.

[9]RAMASUBRAMANIAN L,RESTUCCIA C,DEETH H C.Effect of calcium on the physical properties of stirred probiotic yogurt[J]. Journal of dairy science,2008,91(11):4164-4175.

[10]DAVE R I,SHAH N P.Ingredient supplementation effects on viabil⁃ity of probiotic bacteria in yogurt[J].Journal of dairy science,1998,81 (11):2804-2816.

[11]LUCAS A,SODINI I,MONNET C,et al.Probiotic cell counts and acidification in fermented milks supplemented with milk protein hy⁃drolysates[J].International Dairy Journal,2004,14(1):47-53.

[12]MCCOMAS K A,GILLILAND S E.Growth of probiotic and tradi⁃tional yogurt cultures in milk supplemented with whey protein hy⁃drolysate[J].Journal of food science,2003,68(6):2090-2095.

[13]OLIVEIRA M N,SODINI I,REMEUF F,et al.Effect of milk sup⁃plementation and culture composition on acidification,textural prop⁃erties and microbiological stability of fermented milks containing pro⁃biotic bacteria[J].International Dairy Journal,2001,11(11):935-942.

[14]OZCAN-YILSAY T,LEE W J,HORNE D,et al.Effect of trisodi⁃um citrate on rheological and physical properties and microstructure of yogurt[J].Journal of dairy science,2007,90(4):1644-1652.

Effect of casein phosphopeptide-calcium complex on fermentation properties and microstructure of yogurt

LIU Ze-peng,ZHU Yuan,WANG Ting-ting,ZHAO Li-li,MAO Xue-ying
(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083，China)

The effects of casein phosphopeptide-calcium complex(CPP-Ca)on the fermentation and product properties of yogurt were ex⁃plored.The changes of pH value,titration acidity,lactic acid bacteria count of yogurt which was added CPP-Ca complex were determined. The microstructure of yogurt was observed by confocal laser scanning microscopy.The results indicated that the addition of CPP-Ca com⁃plex could reduce the pH values,increase the titration acidity,and had no significant difference on the lactic acid bacteria counts during the fermentation.In addition,the addition of CPP-Ca complex increased the diameter size of gel pores and augmented the continuity and uni⁃formity of the gel structure,which decreased the whey separation of yogurt.

casein phosphopeptide-calcium complex;yogurt;fermentation properties

Q93-33

A

1001-2230（2016）09-0004-03

2016-03-29

中国农业大学本科生科研训练计划；现代农业产业技术体系北京市奶牛创新团队；“十二五”国家科技支撑计划（2013BAD18B12-05）。

刘泽朋（1994-），男，本科，研究方向为功能性乳制品。

毛学英