春繁期补饲花粉和橡胶蜂蜜对中蜂囊状幼虫病的防控探究

张学文，杨 爽，2*，宋文菲，苗春辉，陈顺安，黄新球，罗卫庭

（1.云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101；2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801）

春繁期补饲花粉和橡胶蜂蜜对中蜂囊状幼虫病的防控探究

张学文1，杨 爽1，2*，宋文菲1，苗春辉1，陈顺安1，黄新球1，罗卫庭1

（1.云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101；2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801）

中蜂囊状幼虫病（简称中囊病）是危害中华蜜蜂养殖最为严重的病毒病，中蜂一旦感染中蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbrood virus，CSBV），很难治愈。为研究营养饲喂对中囊病的防治效果，在春繁期定期对已检测患中囊病的蜂群补充饲喂花粉和橡胶蜂蜜，利用RT-PCR技术检测饲喂后蜂群中成年工蜂、工蜂幼虫和雄蜂幼虫感染CSBV情况。结果显示，补饲花粉和橡胶蜂蜜后，感染CSBV蜂群中成年工蜂、工蜂幼虫和雄蜂幼虫均携带CSBV，染病率分别为91.7%、50.0%和100.0%，但蜂群“烂子”明显减轻，患病蜂群由显性感染转为隐性感染。表明春繁期补充饲喂花粉和橡胶蜂蜜对中囊病有一定的防控效果，能提高蜂群的抗病力，但不能根除CSBV。

中华蜜蜂；囊状幼虫病；春繁期；花粉；橡胶蜂蜜；补充饲喂

蜜蜂囊状幼虫病（sacbrood disease）简称囊幼病，又叫尖头病、囊雏病，是由囊状幼虫病毒（sacbrood virus，SBV）感染引起的一种对蜜蜂幼虫危害巨大的传染病［1］，感染SBV的蜜蜂幼虫皮下积累大量蜕皮液不能化蛹［2］，极大地影响蜂群的群势和生产能力。感染中华蜜蜂的囊幼病被称为中蜂囊状幼虫病（简称中囊病），病原为中蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbrood virus，CSBV）［3］。蜂群一旦患上中囊病，很难治愈。目前，对于中囊病主要采取预防为主的策略，包括降低巢内湿度、补充蜂群营养、提高蜂群抵抗力等［4］。

中囊病的发生与外界气候、蜜源、蜂种等有密切的关系，具有明显的季节性，多发生在春繁和秋繁季节［5］，发病初期，患病死虫被工蜂消除或封盖后的幼虫被工蜂咬破，蜂王重新产卵，封盖子脾出现严重的“花子现象”，即“花子脾”和“穿孔子脾”。CSBV主要危害蜜蜂幼虫，也能侵染蜂蛹和幼年成蜂，CSBV在成蜂体内繁殖，特别是在工蜂的咽下腺和雄蜂的脑内积累，感染CSBV的工蜂并不会表现出明显的临床症状［6］，但CSBV在其体内潜伏时间很长，会缩短成蜂寿命，并引起其生理和行为的改变［7-8］。

春繁期蜂群开始扩巢育子，蜂群子脾大，群内幼虫多，一旦蜂群缺蜜或花粉，幼虫就会营养不良，使得抵抗力也下降，为CSBV的繁殖提供了良好的条件［9］。营养充足是蜂群健康和增强抗病力的重要基础，胡宗文等［10-11］报道春繁期补充饲喂花粉对中蜂群势有促进作用，蜂群封盖子数量随饲喂花粉时间的推移逐渐增加；同时，补充饲喂花粉的幼蜂在形态学特征上更接近于正常发育的成年蜂，补饲花粉能促进工蜂的健康发育。CSBV的季节性变化，从某种程度上反映出蜂群对于病毒具有不同的抵抗力［4］。鉴于此，为研究营养饲喂对中囊病的防治效果，在春繁期定期对已检测患中囊病的蜂群饲喂花粉和橡胶蜂蜜，利用RT-PCR技术检测饲喂后蜂群中成年工蜂、工蜂幼虫和雄蜂幼虫染CSBV情况，以期为中囊病的传播机理和防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验蜂群（3群）由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所提供，2015年10月检测实验蜂群内成年工蜂和雄蜂精液均携带CSBV；蜂蜜为橡胶蜂蜜，花粉为杂花粉和代用花粉，均由云南省普洱蜜海养蜂农业专业合作社提供。

总RNA提取试剂Trizol、TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）购自TaKaRa公司，其余试剂均为国产或进口分析纯试剂。

1.2 蜂群饲喂和样本采集

花粉饲喂。杂花粉、代用粉、白糖按1∶1∶1比例，用水调成团，蒸15 min成饼，放框梁，间隔5 d饲喂1次，饲喂时间2015年12月26日至2016年3月10日。

糖水饲喂。白糖和水按1∶1比例，每群200mL，于2015年12月30-31日饲喂2次。

蜂蜜饲喂。按每群0.3 kg橡胶蜂蜜，持续不间断饲喂蜂群，饲喂时间2016年1月20日至2月21日。

饲喂后样品采集时间为2016年3月29日，每群采集成年工蜂、工蜂幼虫和雄蜂幼虫各10只，-80℃保存。

1.3 总RNA提取

将样品分装于1.5 m L离心管内，各加入1 m L Trizol，用玻璃研棒充分匀浆，静置5 min，加入200μL氯仿，震荡，静置2 min，4℃12 000 r· min-1离心15 min；取上清液300μL，加等量的异丙醇，混匀，静置10 min，4℃10 000 r·min-1离心10 min；沉淀以75%DEPC酒精洗，4℃10 000 r· min-1离心5 min；倒去酒精，真空抽干，用40μL RNase Free dH2O溶解，-80℃保存备用。

1.4 引物设计和RT-PCR扩增

根据GenBank中SBV全序列保守区段设计扩增CSBV片段基因引物，上游引物：5’-ACCAACCGATTCCTCAGTAG-3’，下游引物：5’-CCTTGGAACTCTGCTGTGTA-3’。RT-PCR扩增体系（20μL）：RNase Free dH2O 8.7μL，MgCl2（25 mmol·L-1）4.0μL，10×One Step RNA PCR Buffer 2.0μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1）2.0μL，RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.3μL，AMV Reverse Transcriptase XL（5 U·μL-1）0.3μL，AMV-Optimized Taq polymerase（5 U·μL-1）0.3μL，上、下游引物各0.8μL，RNA 0.8μL。反应条件：50℃反转录30 min，94℃预变性2 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 m in，共35个循环。产物于1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

2 结果与分析

2.1 饲喂前采样观察和RT-PCR检测结果

饲喂前，采样观察群1、群2、群3蜂群封盖子脾“烂子”严重；RT-PCR检测群1、群2、群3雄蜂精液和成年工蜂各5个样本，结果（图1—2）显示，雄蜂精液染病率分别为100%、100%和40%，成年工蜂3群染病率均为100%，蜂群表现为显性感染。

图1 雄蜂精液CSBV检测结果

图2 雄蜂精液和成年工蜂CSBV检测结果

2.2 饲喂后采样观察和RT-PCR检测结果

饲喂后，采样观察群1封盖子脾“烂子”严重，群2、群3无“烂子”现象，观察不出患病情况；RT-PCR检测群1、群2、群3成年工蜂、工蜂幼虫和雄蜂幼虫各4个样本，结果（图3—5）显示，成年工蜂、工蜂幼虫和雄蜂幼虫均携带CSBV，染病率分别为91.7%、50.0%和100.0%，群1表现为显性感染，群2、群3表现为隐性感染。

图3 群1成年工蜂和工蜂幼虫CSBV检测结果

图4 群2成年工蜂和雄蜂幼虫CSBV检测结果

图5 成年工蜂、雄蜂和工蜂幼虫CSBV检测结果

3 小结与讨论

春繁期间，蜂群群势增长激烈，蛋白质的摄入量对蜂群增长起决定性作用。蜂群营养不良是发生疾病的重要诱因，保证蜂群充足而全面的营养是预防和治疗蜂病的重要措施［12］。试验中对检测患有中囊病的蜂群定期补饲花粉、糖水和橡胶蜂蜜，发现蜂群中“花子脾”和“穿孔子脾”明显减少，其中群2、群3补充饲喂前幼虫烂子严重，饲喂后已观察不出患病症状，说明春繁期补充饲喂对中囊病有一定的防治效果，这与刘俊峰等［13］研究报道相符，即春繁期蜂群内蜂花粉短缺，营养供不上，会出现幼虫被拖等情况。春繁期蜂群中充足的蛋白质供给不仅能保障蜜蜂健康发育，而且强壮的体格在防御外敌入侵和获得充足的食物中有明显优势，也为蜜蜂在复杂多变的环境中生存繁殖提供了基础。

通过RT-PCR检测发现补充饲喂后蜂群中成年工蜂、工蜂幼虫和雄蜂幼虫均携带CSBV，染病率分别为91.7%、50.0%和100.0%，与饲喂前雄蜂精液CSBV感染率80%和成年工蜂CSBV感染率100%一致，表明春繁期补充饲喂花粉和橡胶蜂蜜不能根除CSBV。试验中患病蜂群在补充饲喂花粉和橡胶蜂蜜后无明显发病症状，可能是补充饲喂后，蜂群内蜜粉源充足，蜂群群势恢复，繁育新蜂，增强了蜂群对病害的抵抗能力，患病蜂群由显性感染转为隐性感染，这与宋文菲等研究报道的蜂群中CSBV隐形感染大于显性感染一致［14-15］。CSBV隐性感染虽不出现临床症状，但病毒仍在寄主体内增殖并通过寄主散播传染。春繁季节，外界气候多变，蜂群易出现蜜粉源供应不足，此时潜伏在蜜蜂体内的病毒可能受蜂群内外环境的变化而突发症状。因此，在春繁期，应适当补充饲喂额外的花粉和蜂蜜，以满足蜂群的生长繁殖，进而控制中囊病的爆发。

［1］ 周亮，王振国，宋战昀，等.蜜蜂囊状幼虫病RNA依赖的RNA聚合酶部分基因的克隆和序列分析［J］.中国畜牧兽医，2010，37（11）：50-52.

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［3］ 杨冠煌，张弓弨，杜芝兰.中蜂囊状幼虫病病原鉴定［J］.中国蜂业，1979（5）：17-18.

［4］ 尹伟轩.囊状幼虫病毒在中华蜜蜂幼虫体内的增殖规律研究［D］.福州：福建农林大学，2014.

［5］ ANDERSON D L，GIBBS A J.Inapparent virus-infections and their interactions in pupae of the honey bee（Apis mellifera Linnaeus）in Australia［J］.Journal of General Virology，1988，69（7）：1617-1625.

［6］ ANDERSON D L，GIBBS A J.Transpuparial transmission of Kashmir bee virus and sacbrood virus in the honey bee（Apis mellifera）［J］.Annals of Applied Biology，1989，114（1）：1-7.

［7］ GRABENSTEINER E，RITTER W，CARTER M J，et al. Sacbrood virus of the honeybee（Apis mellifera）：rapid identification and phylogenetic analysis using reverse transcription-PCR［J］.Clinical&Diagnostic Laboratory Immunology，2001，8（1）：93-104.

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［9］ 李薇.中华蜜蜂囊状幼虫病毒（CSBV）VP1蛋白基因序列特征及原核表达［D］.北京：中国农业科学院，2014.

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［12］ 李肖.饲料蛋白源对意大利蜜蜂繁蜂效果及蜂王浆品质的影响［D］.泰安：山东农业大学，2014.

［13］ 刘俊峰，刘光楠，颜伟玉，等.三种人工饲料对中华蜜蜂春繁的影响［J］.江西农业大学学报，2011，33（1）：137-140.

［14］ 宋文菲，沈登荣，杨爽，等.蜜蜂囊状幼虫病毒多聚蛋白基因遗传结构分析［J］.西南师范大学学报（自然科学版），2015（7）：102-107.

［15］ 宋文菲，张学文，张祖芸，等.中蜂囊状幼虫病病毒检测及地区间遗传变异［J］.中国农学通报，2013（17）：42-46.

（责任编辑：卢福庄）

S895.1

：A

：0528-9017（2016）12-2114-03

文献著录格式：张学文，杨爽，宋文菲，等.春繁期补饲花粉和橡胶蜂蜜对中蜂囊状幼虫病的防控探究［J］.浙江农业科学，2016，57（12）：2114-2117.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161261

2016-09-20

国家蜂产业技术体系专项（CARS-45-SYZ 17）；国家自然科学基金（31560676）

张学文（1965-），男，云南永仁人，副研究员，从事蜜蜂资源、饲养及授粉研究工作，E-mail：zxw216226@163.com。通信作者：杨 爽，E-mail：yangshuang19860724@163.com。