ICOS在健康人外周血调节性T细胞上的生物学特征初探①

程 莎 高基民

(浙江省立同德医院，杭州310012)

ICOS在健康人外周血调节性T细胞上的生物学特征初探①

程 莎 高基民

(浙江省立同德医院，杭州310012)

目的：研究ICOS在健康人外周血Treg离体培养中的作用，了解mTOR对离体培养Treg ICOS表达的调控。方法：MACS分选Treg后经anti-CD3+anti-CD28磁珠刺激后第3、7天流式检测Treg表面ICOS表达情况；anti-CD3+anti-CD28抗体或anti-CD3+ICOSL-Fc刺激3 d，流式检测Treg ICOS表达情况；雷帕霉素处理离体培养Treg，流式分析其对Treg ICOS表达作用。CFSE标记人PBMC细胞，并与离体培养Treg混合培养，流式检测Treg的接触抑制活性。结果：anti-CD3+anti-CD28磁珠刺激Treg 3 d，ICOS+Treg中活、死细胞的比例分别为(92.00±2.69)%和(2.20±0.56)%，在ICOS-Treg中比例为(90.30±3.53)%和(1.77±0.78)%，两者无显著差异；培养第7天，ICOS+Treg细胞比例从第3天(40.20±1.83)%降至(11.60± 1.10)%；anti-CD3 +ICOSL-FC刺激Treg 3 d后，ICOS MFI为(403.30±74.42)，anti-CD3+anti-CD28刺激组为(2 410.0±746.4)，anti-CD3+ICOSL-FC刺激后Treg ICOS表达相比anti-CD3+anti-CD28组显著下降；雷帕霉素处理离体培养Treg细胞3 d后， ICOS表达下调。此外，雷帕霉素处理的离体培养Treg均能有效抑制PBMC中Tcon的分裂增殖。结论：ICOS表达高低对人外周血Treg存活率影响无显著差异，mTOR信号并非调控人Treg离体培养ICOS表达的唯一因素，CD28协同信号对调控离体培养人Treg 。表达比ICOSL信号更为重要，雷帕霉素处理的离体培养人Treg 仍具有细胞接触抑制活性。

人调节性T细胞；雷帕霉素；可诱导共刺激分子；可诱导共刺激分子配体

调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是T细胞的一个亚群，约占CD4+T细胞的5%～10%，表达CD4、CD25、GITR/AITR、CTLA-4、ICOS和转录因子Foxp3，其中Foxp3为Treg的主要标志蛋白[1,2]。Treg能抑制对自身或外源抗原有害的免疫反应，在维持免疫耐受和预防自身免疫性疾病中起着重要的作用[3]。

可诱导共刺激分子(Inducible costimulator，ICOS)是CD28家族的第3成员，由德国学者Hutloff于1999年在人活化后的外周血T细胞表面发现，由于ICOS-ICOSL提供正向刺激信号，有许多研究通过阻断ICOS-ICOSL共刺激通路诱导受体对移植物免疫耐受或治疗自身免疫病[4，5]。然而，ICOS不但表达于效应T细胞，在Treg细胞也有表达，有研究表明 ICOS缺陷的病人体内Treg功能明显缺陷，且易发生自身免疫性疾病[6]。在小鼠体内，高表达ICOS的Treg细胞具有存活率高、接触抑制功能和分裂增殖能力强的特点[7]。而在小鼠哮喘模型中，ICOS-ICOSL通过调节Treg的功能引起呼吸道免疫耐受[8]。并且近年来越来越多的数据显示，ICOS-ICOSL对Treg免疫抑制的功能起着不可或缺的作用[9]。但以往的研究结果主要集中在阐明ICOS在CD4+T细胞上的表达变化及ICOS-ICOSL共刺激途径对CD4+T细胞的功能作用。在本研究中观察健康人外周血中Treg细胞体外刺激时ICOS的表达变化，为ICOS-ICOSL共刺激途径对Treg功能作用的进一步研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂 健康人外周血100 ml/人，共20例，本研究经过浙江省立同德医院伦理委员会批准，所有受试者均知情并签署知情同意书；淋巴细胞分离液购于TBD公司；Treg Expansion Kit、CD4+CD25+CD127dim/-Regulatory T Cell Isolation Kit Ⅱ human、MACS Buffer购自美天旎公司；标准胎牛血清、IMDM培养基、β-巯基乙醇购于Gibco公司；重组人ICOSL-FC购于R&D公司；重组人IL-2购自Peprotech公司；anti-human CD3单抗和anti-human CD28单抗购自BioLegend公司；PE-anti-human Foxp3、APC-anti-human ICOS、FITC-anti-human CD4、Hu-man Regulatory T cell Staining Kit购自eBios-cience公司；LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit(L/D)购于Invitrogen公司。 仪器：CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；FACS Aria流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 外周血Treg的体外分离与流式抗体荧光染色 抽取健康人外周血100 ml，密度梯度离心法提取外周血单个核细胞，MASC法分离CD4+CD25+CD127dim/-调节性T细胞，按MACS磁珠分选试剂盒说明书操作。取一小部分分选后的Treg细胞重悬后加入CD4-FITC、ICOS-APC流式抗体和L/D染料，4℃避光孵育30 min，PBS洗涤2遍。胞内核转录因子Foxp3按照eBioscience Treg染色试剂盒说明染色，将上述PBS洗涤后的细胞中加入新鲜配置的破膜固定缓冲液，4℃避光破膜固定2 h，再将细胞用1×破膜缓冲液洗涤2遍，并重悬于1×破膜缓冲液，加入Foxp3-PE流式抗体4℃避光孵育30～60 min后，1×破膜缓冲液洗涤2遍，细胞重悬于PBS中,流式细胞术检测磁珠分选效果。

1.2.2 ICOS在调节性T细胞表面表达情况检测 分选得到的Treg细胞以1×105/孔接种于96孔板(平底)，培养体积为200 μl/孔。培养液为IMDM完全培养基(含有10%胎牛血清，青、链霉素各50 U/ml，β-巯基乙醇55 μmol/L,IL-2:500 U/ml)。anti-CD3+anti-CD28抗体 MACSiBead与细胞的比例为 4∶1。分别取体外培养3、7 d Treg细胞，进行CD4、ICOS、L/D和Foxp3染色后，流式细胞仪检测ICOS在Treg细胞表面表达情况。流式抗体和L/D染料染色方法同上。

1.2.3 ICOSL Fc对离体培养Treg中ICOS表达的影响 将1 μg/ml anti-human CD3+ 0.5 μg/ml anti-human CD28或1 μg/ml anti-human CD3+ 5 μg/ml ICOSL FC预包板过夜(4℃)。分选后Treg细胞以1×105/孔接种于包被有anti-human CD3+anti-human CD28或anti-human CD3+ ICOSL-FC的96孔培养板中，培养方法同1.2.2。将实验分为anti-human CD3+anti-human CD28刺激组和anti-human CD3+ ICOSL-FC刺激组。第3天，收集细胞，进行CD4、ICOS、L/D和Foxp3染色，流式细胞仪检测ICOS在Treg细胞表面表达情况。

1.2.4 雷帕霉素对外周血离体培养Treg中ICOS表达的影响 分选后Treg培养方法同1.2.2，anti-CD3+anti-CD28抗体 MACSiBead与细胞的比例为 4∶1。培养第1天，在上述培养细胞中加入雷帕霉素，分为雷帕霉素处理组(1、10和100 nmol/L雷帕霉素)和未处理组。收集培养第3天的细胞，进行CD4、ICOS、L/D和Foxp3染色，流式细胞仪检测ICOS在Treg细胞表面表达情况。

1.2.5 雷帕霉素处理后离体培养的Treg接触抑制活性检测 将新鲜分离的PBMC与5 μmol/L CFSE 37℃ 避光孵育9 min，加入1 ml 胎牛血清终止反应，并用IMDM完全培养液洗涤2遍后，收集以1 nmol/L雷帕霉素扩增培养14 d的Treg，按4∶1、8∶1、16∶1比例(PBMC/Treg)混合，并加入1 μg/ml anti-human CD3刺激4 d。同时，设立PBMC单独刺激组为阳性对照组，以PBMC未刺激组为阴性对照。

1.3 统计学分析 流式细胞数据用Tree star Flowjo 7.5软件进行分析处理，分析后实验数据采用GraphPad Prism 5.0 软件进行统计分析和作图。双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ICOS在健康人外周血Treg上的表达与细胞生存之间的关系 为研究健康人外周血Treg在刺激活化后ICOS的表达与Treg细胞在体外存活之间的关系，我们对10例健康人外周血的Treg离体培养结果进行分析发现，刺激3 d后ICOS+Treg细胞中活细胞比例为(92.00±2.69)%，死细胞比例为(2.20±0.56)%，而ICOS+Treg细胞中活细胞比例为(90.30±3.53)%，死细胞比例为(1.77±0.78)%。ICOS+Treg细胞与ICOS-Treg细胞在细胞存活率上并无显著差异(图1A～C)。此外，在新鲜分离的健康人外周血Treg细胞中，ICOS+Treg与ICOS-Treg细胞的存活率之间也无显著性差异(图1D～F)。

图1 健康人外周血Treg中ICOS表达及细胞存活率检测Fig.1 Detection of cell survival and ICOS expression level on human blood Treg cellsNote:A-C.The viability of Treg was stimulated with anti-CD3+anti-CD28 beads for 3 days;D-F.The viability of fresh isolated Treg from human PBMC with MACS protocol were analyzed by flow cytomertry.

2.2 ICOS在健康人外周血Treg细胞表面表达的时效性 为研究Treg体外刺激活化后ICOS的表达变化情况，分选得到的Treg用anti-CD3+anti-CD28磁珠刺激培养后，分别在第3天和第7天检测Treg细胞表面ICOS的表达情况。结果表明，刺激后的第3天ICOS+Treg比例为(40.20±1.83)%，而在第7天， ICOS+Treg 细胞比例下降为(11.60± 1.10)%，相对于第3天显著降低(P=0.000 2)，见图2。

2.3 ICOSL对健康人Treg细胞ICOS表达的影响 分选后的 Treg，分别用anti-CD3+anti-CD28单抗和anti-CD3单抗+ICOSL-FC刺激，第3天流式细胞术检测ICOS表达水平发现，刺激3 d后， anti-CD3+anti-CD28刺激组中Treg细胞ICOS MFI(2 410.0±746.4，n=3)，而加入anti-CD3+ICOSL-FC刺激后Treg细胞的ICOS MFI为(403.30±74.42，n=3)，相对于anti-CD3+anti-CD28 刺激组显著下降(P=0.027 7)，见图3。

2.4 雷帕霉素处理离体培养的Treg接触抑制功能检测 将雷帕霉素处理的离体培养Treg细胞与CFSE标记的新鲜分离人外周血PBMC混合刺激培养4 d，分析CFSE阳性细胞群PBMC中CD4、CD8 T细胞的分裂增殖峰发现，未混有Treg的PBMC中，CD4和CD8刺激4 d后均产生3个分裂峰。在Treg和PBMC混合培养的细胞中，PBMC细胞的分裂增殖能力随着Treg细胞比例的增加而逐渐降低，1∶4和1∶8的混合比例中，Treg仍然具有较好的抑制活性，尤其对CD8 T细胞的抑制作用更为显著(图4A、B)。

2.5 雷帕霉素处理离体培养的Treg中ICOS表达的检测 分选后的Treg离体培养时经1、10、100 nmol/L，雷帕霉素处理，培养3 d后流式细胞分析发T现，三种不同的雷帕霉素浓度均能导致离体培养后Treg中ICOS表达的下调，但两者并未呈剂量依赖的关系。该结果表明，mTOR信号通路与离体培养中Treg细胞ICOS表达有关，但并非唯一的调控信号(图5)。

图2 离体培养的Treg中ICOS表达的时效性Fig.2 Effectiveness of ICOS expression on in vitro cultured Treg cellsNote:A.ICOS expression on purified Treg was stimulated with anti-CD3+anti-CD28 beads on day 3 and day 7；B.The ICOS+ Treg-cell percentage.

图3 ICOSL Fc对分选后离体培养的Treg中ICOS表达的影响Fig.3 Influence of ICOS expression on in vitro cultured Treg cells by ICOSL FcNote:A.ICOS expression on purified Treg was stimulated with anti-CD3+anti-CD28 or anti-CD3+ICOSLFc on day 3；B.The MFI of ICOS+ Treg.

图4 Treg 接触抑制活性检测Fig.4 Test of Treg cells suppress capacityNote:A. PBMC proliferation assay；B.Treg/Tcon contact inhibition assay were analyzed by FACS via Rapamycin treatment.

图5 不同浓度雷帕霉素处理对离体培养Treg细胞ICOS表达的影响Fig.5 Influence of ICOS expression on in vitro cultured Treg cells by treatment of different concentration of rapamycin

3 讨论

ICOS为两个同源二聚体同源跨膜蛋白，分为胞外区和胞浆区，其胞外区能与ICOSL结合，而胞浆区含有YMFM基序，能与PI3K激酶结合，启动下游信号通路[10-12]。ICOS为诱导表达，常见于活化后的T细胞和记忆性T细胞表面， 而在初始T细胞表面无表达。ICOS的配体ICOSL在B细胞表面持续表达，在单核细胞和抗原递呈细胞表面一般为可诱导表达，且表达水平较低[13,14]。

目前有关ICOS与Treg的作用关系尚未被阐明，Chen等[7]发现小鼠外周Treg中，存在高表达ICOS和低表达ICOS两种Treg分群，前者能增强Treg细胞的免疫抑制活性和分裂增殖能力，提高Treg细胞的存活率。而Ito等[15]发现在人外周血中胸腺发育来源天然Treg分为ICOS+和ICOS-两群，两类Treg细胞在接触抑制功能方面存在不同。而我们也发现在体外刺激的Treg中也存在ICOS+/ICOS-两类Treg细胞，但进一步研究发现上述两类Treg的存活率未存在显著的差异。Chen等[7]在其报道中虽然指出小鼠外周高表达ICOS的Treg细胞与低表达ICOS的Treg细胞存在功能差异，但我们并不确定这种差异也存在人外周血Treg。至此，我们的研究结果进一步验证和完善了Ito[15]和Chen[7]这两个研究小组的发现，即小鼠脾脏和淋巴结Treg细胞和人外周血Treg细胞可能存在功能上的差异，并且在体外刺激培养的Treg中也是如此。Hu等[16]发现Treg细胞中特异性敲除Raptor导致Treg中ICOS表达下调，mTORC1对小鼠Treg细胞的发育和功能有重要作用。我们对人外周血调节性T细胞经mTOR抑制剂雷帕霉素处理并离体培养后发现，Treg细胞的ICOS表达下调，因此，mTOR信号通路不仅对小鼠脾脏和淋巴结中Treg细胞ICOS表达有关[17，18]，同样在离体培养的人外周血Treg中，雷帕霉素能部分抑制Treg细胞ICOS的表达，表明除mTOR信号外还有其他的通路参与调控离体培养人外周血Treg细胞ICOS的表达。ICOSL是ICOS的特异配体，Colbeck[19]和Miller[20]等研究团队发现，ICOSL/ICOS信号途径对Treg细胞抑制功能的发挥和维持及Treg诱导的肿瘤免疫耐受有重要作用，其具体机制尚未明确。我们研究发现ICOSL-Fc代替CD28刺激离体人外周血Treg细胞发现，与CD28刺激组相比，Treg细胞ICOS表达下调，表明虽然ICOSL为ICOS的特异配体，能刺激ICOS的表达，但与CD28信号相比还不足以完全上调离体培养的人外周血Treg细胞ICOS的表达。此外，我们还发现雷帕霉素处理后离体培养的人外周血Treg细胞仍然具有细胞接触抑制活性，且相比CD4 T细胞，对CD8 T细胞的抑制作用更为显著，其原因可能是由于CD8 T细胞对Treg细胞更为敏感，另外也可能是健康人PBMC中CD8 T细胞比例低于CD4 T细胞所引起的。

综上所述，ICOS 对调节人Treg细胞功能有重要作用，而有关机制尚不清楚。本研究发现mTOR信号是离体培养的人Treg细胞ICOS表达的重要调控信号，但并非唯一调控因素，而ICOS表达在离体培养的人Treg细胞存活率无显著作用，且CD28协同信号比单一ICOSL信号对ICOS的表达更为重要。因此，本研究对进一步阐明mTOR-ICOS/ICOSL信号在人外周血Treg细胞中的作用和影响有重要意义，并为推动以ICOS和Treg切入点，对自身免疫性疾病和肿瘤开展靶向治疗提供科学依据。

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[收稿2015-12-29 修回2016-04-20]

(编辑 倪 鹏)

Role of ICOS on in-vitro cultured human PBMC Treg

CHENG Sha，GAO Ji-Min.

Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou 310012,China

Objective:To investigate the role of mTOR in regulation of ICOS expression in human blood regulatory T cells.Methods:Isolation of Treg cells from human PBMC using MACS beads.We detected the ICOS expression on purified Treg cells and Treg cells viability using flow cytometry in anti-CD3 plus anti-CD28 (antibody or beads) or anti-CD3 plus ICOSL-Fc for 3 days and 7 days.CFSE labeling human PBMC cells and in vitro cultured Treg mixed,Treg contact inhibition activity was detected by flow analysis.Results:After in vitro stimulation of Treg cells in the presence of anti-CD3+anti-CD28 for 3 days,there was no significant statistic difference in viability between ICOS+(92.00±2.69)% and ICOS-(90.30±3.53)% Treg-cells.After cultured for 7 days,the decreased ICOS+Treg cells percentage within total Treg cells from(40.20±1.83)% to (11.60± 1.10)% compared with that of 3 days.Further more,the ICOS expression level between stimulated with anti-CD28 or ICOSL-Fc condition group,compared with the ICOS MFI in the condition of anti-CD3 plus anti-CD28 treatment for 3 days was (2410.0±746.4) obviously higher than (403.30±74.42),that of the group treated with anti-CD3 plus ICOSL-FC.Rapamycin could partially suppress Treg cells ICOS expression,but unaffected the Treg suppression ability.Conclusion:ICOS expression level may not important for in vitro cultured human PBMC Treg cells survival although mTOR signling is important for regulation ICOS expression on in-vitro cultured Treg cells,but the ICOS expression on Treg regulated by multiply signaling pathways.CD28 signaling is the key stimulation factor for ICOS upregulation on in-vitro cultured Treg cells compared to ICOSL signaling.

Human regulatory T-cell；Rapamycin；ICOS；ICOSL

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.005

①本文受浙江省医药卫生科技计划(2014KYA237)资助。

程 莎 (1982年-)，女，硕士，检验师，主要从事调节性T细胞发育调控及其在自身免疫性疾病中的作用研究。

及指导教师：高基民 (1964年-)，男，教授，博士生导师，主要从事T淋巴细胞发育调控及其在肿瘤、器官移植和自身免疫性疾病中的作用研究，E-mail：jimingao64@163.com。

R932.1

A

1000-484X(2016)12-1753-05