苁蓉精对MPP+诱导多巴胺能神经细胞损伤后GSK-3β表达的影响

覃威 叶水芬 范雯 魏维 许茜 蔡晶

苁蓉精对MPP+诱导多巴胺能神经细胞损伤后GSK-3β表达的影响

覃威 叶水芬 范雯 魏维 许茜 蔡晶

目的 观察苁蓉精水提物及苁蓉精纳米微粉对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导损伤的多巴胺能神经细胞MES23.5细胞中帕金森病相关蛋白α-突触核蛋白(α-synuclein)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、Tau蛋白表达的影响，探讨苁蓉精治疗帕金森病的作用机制。方法 分别将苁蓉精水提物及纳米微粉经PBS溶解后加入培养基使终浓度为100、200、250 μg/mL，孵育MPP+诱导的PD模型细胞24 h后，并设模型对照(MPP+诱导的PD模型细胞，不加干预)及空白对照组(未经任何处理的MES23.5细胞)，以MTT法检测细胞的存活率，Western Blot法测定各组细胞内α-synuclein、GSK-3β、Tau蛋白表达。结果 同空白对照组比较，模型组及苁蓉精水提物及纳米微粉100、200、250 μg/mL组α-synuclein、GSK-3β及Tau蛋白的磷酸化水平均升高(分别P<0.01、P<0.05)；与模型组比较，苁蓉精水提物及纳米微粉100、200、250 μg/mL组α-synuclein、GSK-3β及Tau蛋白的磷酸化水平均显著降低(分别P<0.01、P<0.05)。除苁蓉精纳米微粉100 μg/mL组GSK-3β磷酸化水平与苁蓉精水提物100 μg/mL组比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其余各苁蓉精纳米微粉组α-synuclein、GSK-3β及Tau蛋白的磷酸化水平均低于相同浓度的苁蓉精水提物组(分别P<0.01、P<0.05)。结论 苁蓉精水提物及苁蓉精纳米微粉均能够减轻MPP+诱导的PD模型细胞的损伤，且苁蓉精纳米微粉的效果相对较好。其机制可能与苁蓉精可以减少α-synuclein的聚集，降低GSK-3β的活性，抑制Tau蛋白的过度磷酸化有关。

苁蓉精水提物；苁蓉精纳米微粉；帕金森病；MES23.5细胞；神经保护

帕金森病(Parkinson disease，PD)是以黑质-纹状体多巴胺能神经元进行性变性坏死、多巴胺递质缺乏为主要病理基础的常见老年中枢神经系统退行性疾病[1]。近年来研究发现帕金森相关蛋白α-突触核蛋白(α-synuclein)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、Tau蛋白对于PD的发病和发展以及多巴胺神经元的保护具有重要的调节作用[2-3]。本课题组前期研究表明苁蓉精水提物能够通过调控神经凋亡因子及神经营养因子的表达，抑制多巴胺神经细胞的凋亡，起到神经保护的作用[4]。本文以多巴胺能神经细胞MES23.5细胞为研究对象，用1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenyl-pyridinium，MPP+)诱导建立PD的体外细胞损伤模型，观察苁蓉精水提物及苁蓉精纳米微粉对MPP+损伤的MES23.5细胞的存活率以及PD相关蛋白α-synuclein、GSK-3β、Tau蛋白表达的影响，并初步探讨其神经保护作用机制，以期为防治PD提供相关实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 MES23.5多巴胺能神经细胞系首都医科大学神经生物学实验室陈彪教授赠送。苁蓉精方(由肉苁蓉10 g，淫羊藿10 g，黄精18 g三味中药组成，购于福建中医药大学附属第三人民医院)，MPP+、4-甲基耦氮唑蓝(MTT)、谷氨酰胺为Sigma公司产品；DMEM/F12培养基和胎牛血清为Gibco公司产品；α-synuclein、GSK3β、Tau蛋白、磷酸化的Tau蛋白(Phospho-Tau)、磷酸化的糖原合成酶激酶-3β(Phospho-GSK3β)等抗体均购自于美国的cell signaling Technolegy公司。ELX800酶标仪(美国BioTek公司)，CO2培养箱(德国 Heraeus)，Gel DOC 2000型凝胶成像分析系统、电泳仪、电泳槽(美国 Bio-Rad公司)，DU-650型蛋白分析仪(美国 Beckman公司)，5417R高速冷冻离心机(德国 Eppendorf公司)，SXQM型双行星式球磨机(长沙天创粉末技术有限公司)，混合球磨仪(Retsch MM400，德国)。

1.2 方法

1.2.1 苁蓉精水提物的制备：精确称取苁蓉精中药材(肉苁蓉10 g，淫羊藿10 g，黄精18 g)，并进行传统净化、干燥；将药品混匀粉碎，浸泡于药材体积10倍的超纯水中1 h，加热回流2 h，纱网过滤，收集第一次苁蓉精水提液，再加入药材体积10倍的蒸馏水，加热回流2 h，过滤收集第二次苁蓉精水提液，合并两次液体，于旋转蒸发仪中浓缩药。滤液浓缩为浸膏，-20℃保存。使用时将苁蓉精浸膏用PBS溶解配成25 mg/mL母液，超声波震荡仪超声震荡30 min促进浸膏的溶解，高压灭菌，-20℃保存待用。

1.2.2 苁蓉精纳米微粉的制备：精确称取苁蓉精中药材(肉苁蓉10 g，淫羊藿10 g，黄精18 g)，并进行传统净化、干燥；将净化干燥的苁蓉精中药材进行常规粉碎，要求达到可通过200目筛的细粉；将苁蓉精细粉经进一步的冷冻干燥后，采用温度可控真空高能球磨法制备苁蓉精纳米微粉。具体步骤是：原料苁蓉精细粉置于配有深冷外套的真空球磨罐中，同时装入硬质合金磨球，使球与苁蓉精细粉的体积比保持在15︰1～5︰1范围，高能球磨机以转速300 r/min磨制20 min，得到微粉，称取适量微粉进行纳米级材料加工。将上述研磨粉末于混合球磨仪中加工，以25次/s振荡20 s，重复3次。使用时用PBS将苁蓉精纳米微粉溶解配成25 mg/mL母液，超声30 min，高压灭菌，-20℃保存待用。

1.2.3 体外PD模型细胞的建立：MES23.5细胞接种于含5%(体积分数)胎牛血清、1%(质量浓度)谷氨酰胺、2%(质量浓度)50×Sato’s溶液和2%(体积分数)青/链霉素的DMEM/F12培养基，置于37℃、5%(体积分数)CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，用0.25%(质量浓度)胰酶消化传代，收集对数生长期细胞制成细胞悬液。将细胞以细胞密度1×105接种到96孔板中，加入终浓度为100 μmol/L的MPP+培养液培养24 h，建立体外PD模型细胞。

1.2.4 选取适宜的苁蓉精水提物和纳米微粉的干预浓度及干预时间：取上述PD模型细胞，分别加入终浓度为10、50、100、200、250、500、1000 μg/mL的苁蓉精水提物和苁蓉精纳米微粉培养液，作为药物干预组；未加药物的细胞为模型对照组；未加MPP+以及未加药物的正常培养液培养的MES23.5细胞为空白对照组，每个组别均设6个复孔。各组细胞培养24 h和48 h后进行MTT检测细胞存活率，步骤如下：向96孔板中加入5 mg/mL的MTT，37℃培养4小时后，加入150 μL的DMSO，震荡10 min，在酶标仪上选择490 mm的波长，检测各个孔的吸光值，计算细胞的存活率。细胞存活率(%)=实验组吸光度均值/空白对照组吸光度均值×100%。选取各苁蓉精水提物和纳米微粉组中细胞存活率最高三组的浓度、最短时间进行后续的实验。

1.2.5 Western Blot法测定帕金森病相关蛋白α-synuclein、GSK-3β、Tau：取体外PD模型细胞，按上述预实验中选择的苁蓉精水提物及苁蓉精纳米微粉浓度及时间进行干预。然后收集细胞，向上述细胞加入含有RIPA、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的混合裂解液冰上裂解30 min，收集细胞碎片和裂解液于4℃下12000 r/min离心5 min，取上清，提取蛋白，按照同样的方法重复提取蛋白3次。BCA蛋白定量；SDS-PAGE电泳，转膜，5%(质量浓度)脱脂奶粉室温封闭2 h；加入α-synuclein单克隆抗体(1︰1000)、GSK-3β单克隆抗体(1︰1000)、Phospho-GSK3β单克隆抗体(1︰800)、Tau单克隆抗体(1︰1000)、Phospho-Tau单克隆抗体(1︰800)、β-actin单克隆抗体(1︰1000)， 4℃过夜；加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1︰5000)反应1 h；膜上加ECL显影剂，反应2 min，常规显影，用Image Lab软件对蛋白的表达进行半定量分析，分别计算目标蛋白与β-actin、P-GSK-3β与GSK-3β、P-Tau与Tau蛋白的灰度值比。目标蛋白与β-actin的比值表示各个目标蛋白的相对表达量，P-GSK-3β与GSK-3β的比值表示GSK-3β的磷酸化水平，P-Tau与Tau蛋白的比值表示Tau蛋白磷酸化水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0软件进行分析。实验数据均为计量资料，用均数±标准差(x2±s)表示。数据均符合正态分布，各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较，方差齐则采用LSD法；方差不齐则采用Games-Howell法。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物干预的浓度和时间的选择 结果见表1、表2。与空白对照组比较，模型组及各苁蓉精水提物组及苁蓉精纳米微粉组细胞存活率显著降低(均P<0.01)；与模型组比较，各苁蓉精水提物组及苁蓉精纳米微粉组细胞存活率均有一定程度的升高(均P<0.01)，而且苁蓉精水提物组及苁蓉精纳米微粉100、200、250 μg/mL组的细胞存活率均高于其他浓度组及模型组(均P<0.01)。因此，在后续试验中，选择浓度为100、200、250 μg/mL苁蓉精水提物组及苁蓉精纳米微粉干预24 h作为干预条件。

表1 各组MPP+诱导的PD模型细胞存活率比较(n=6，%，±s)

注：与空白对照组比较：*P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01；与水提物 10组比较：ΔP<0.01；与水提物50组比较：○P<0.05，○○P<0.01；与水提物 100组比较：☆P<0.05，☆☆P<0.01；与水提物 200组比较，▲P<0.01；与水提物 250组比较，▼P<0.01；与水提物 500组比较，★P<0.05；水提物10、50、100、200、250、500、1000分别表示苁蓉精水提物浓度为10、50、100、200、250、500、1000 μg/mL

表2 不同浓度苁蓉精纳米微粉对MPP+诱导MES23.5细胞损伤后细胞存活率的影响(n=6，%，±s)

注：与空白对照组比较：*P<0.01；与模型组比较：#P<0.01；与纳米微粉 10组比较：ΔP<0.01；与纳米微粉50组比较：○P<0.05，○○P<0.01；与纳米微粉 100组比较：☆P<0.01；与纳米微粉 200组比较，▲P<0.01；与纳米微粉 250组比较，▼P<0.01；与纳米微粉 500组比较，★P<0.05；水提物10、50、100、200、250、500、1000分别表示苁蓉精纳米微粉浓度为10、50、100、200、250、500、1000 μg/mL

2.2 各苁蓉精水提物组各及苁蓉精纳米微粉组帕金森病相关蛋白表达 与空白对照组比较，模型组α-synuclein蛋白表达量及GSK-3β蛋白和Tau蛋白的磷酸化水平均显著升高(P<0.01或P<0.05)；与模型组比较，各苁蓉精水提物组及各苁蓉精纳米微粉组α-synuclein蛋白表达量、GSK-3β蛋白和Tau蛋白的磷酸化水平降低(P<0.01或P<0.05)；苁蓉精纳米微粉100、200、250 μg/mL组α-synuclein蛋白表达量、Tau蛋白磷酸化水平均低于同浓度苁蓉精水提物组(均P<0.01)；苁蓉精纳米微粉200、250 μg/mL组GSK-3β蛋白的磷酸化水平亦低于同浓度苁蓉精水提物组(均P<0.01)，但苁蓉精纳米微粉100 μg/mL与蓉精水提物100 μg/mL组比较差异无统计学意义(P>0.05)。具体见图1、表3。

3 讨论

注：1表示空白对照组；2表示模型组；3、4、5分别表示苁蓉精水提物浓度为100、200、250 μg/mL，6、7、8分别表示苁蓉精纳米微粉浓度为100、200、250 μg/mL 图1 苁蓉精水提物及纳米微粉干预后MES23.5细胞中a-synuclein、GSK-3β、Tau蛋白的表达及磷酸化水平

PD是一种慢性、进展性的、多因素的神经系统紊乱性疾病，病理过程包括炎性反应、氧化应激、线粒体功能障碍、神经递质失衡、细胞凋亡等[1]。PD的治疗方法主要包括口服左旋多巴、多巴胺受体激动剂和B型单胺氧化酶抑制剂，外科手术植入电极深部刺激丘脑底核和苍白球，或将神经干细胞移植到纹状体。近年来，神经干细胞用于PD的治疗逐渐受到重视[5]。本文将在以往的研究基础上进一步探讨补肾复方苁蓉精对多巴胺能神经细胞的保护作用。

MES23.5细胞是一种杂交瘤性多巴胺能神经元细胞系，是由大鼠的胚胎中脑细胞与小鼠神经母细胞瘤一胶质瘤细胞系N18TG2杂交而成，可替代原代培养的多巴胺能神经元用于研究神经变性疾病PD[6]。本文采用MPP+诱导MES23.5细胞建立体外PD模型，为研究苁蓉精水提物及苁蓉精纳米微粉的神经保护作用及其相关的机制提供了良好的载体。

中药可以通过各种机制发挥着神经保护作用，包括抗氧化、抗炎、清除自由基、抗凋亡等[7]。本研究中所用苁蓉精水提物及其纳米微粉制剂是由肉苁蓉、淫羊藿、制黄精组成的复方补肾制剂。中药纳米制剂由于其特有的理化性质，具有细胞破壁率高、有效物质溶出率高的优点，可提高生物利用度，增加药物对血脑屏障或生物膜的通透性，增强药物靶向性，从而降低给药剂量，提高药效[8]。本实验中采用苁蓉精水提物和纳米微粉对MPP+诱导损伤的多巴胺能神经细胞MES23.5进行干预，同模型组相比各浓度的苁蓉精水提物组及苁蓉精纳米微粉组细胞存活率均有一定程度的的升高，其中以100、200、250 μg/mL三组升高最为显著。表明时当苁蓉精浓度超过250 μg/mL时，细胞毒性增强。因此，选择浓度为100、200、250 μg/mL苁蓉精水提物及苁蓉精纳米微粉干预24 h作为干预条件。上述结果也提示在未来研究中药的神经保护作用的同时也应该注重毒理学研究，充分考虑毒性作用给实验结果带来的影响。

表3 各苁蓉精水提物组及各苁蓉精纳米微粉组目的蛋白表达量及磷酸化水平比较(n=3，±s)

注：与空白对照组比较：*P<0.05, **P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01；与水提物100比较：ΔP<0.05,ΔΔP<0.01；与水提物200比较：○P<0.05，○○P<0.01；与水提物250比较：☆P<0.01；水提物100、200、250分别表示苁蓉精水提物浓度100、200、250 μg/mL，纳米微粉100、200、250分别表示苁蓉精纳米微粉的浓度为100、200、250 μg/mL

α-synuclein是由140个氨基酸组成的小分子蛋白质，正常生理状况下能形成稳定的α螺旋结构。PD患者α-synuclein的突变可破坏α螺旋结构，使之形成β折叠，进而聚集并产生具有神经毒性作用的寡聚体，最终导致神经变性[9]。Tau蛋白是神经系统广泛表达的微管相关蛋白，其生物学功能是促进微管形成和稳定微管结构的作用，参与神经元的生长发育，维持轴突的形态。Tau的过度磷酸化与细胞凋亡以及神经系统的紊乱有重要的联系[10]。糖元合成酶激酶3β(GSK-3β)是GSK-3两种形式中较小的蛋白，是一段具有482个氨基酸组成的单链多肽，相对分子质量(Mr)为47 000，其结构中包含一个中心蛋白激酶催化结构域。GSK-3β是最重要的催化Tau蛋白磷酸化的蛋白激酶之一，它可催化Tau蛋白上多个丝氨酸或苏氨酸位点的磷酸化。GSK-3β活性表达增加，可以使Tau蛋白的磷酸化增强[11]。进一步的研究表明α-synuclein和Tau两者之间存在着密切的联系。α-synuclein蓄积很可能诱发了GSK-3β的活性，进而促进Tau蛋白的磷酸化水平的增加，α-synuclein充当调节Tau蛋白和GSK-3β的连接，引导GSK-3β对Tau蛋白磷酸化[12]。

本实验显示，采用MPP+诱导MES23.5细胞损伤，建立体外PD模型细胞，然后通过苁蓉精水提物或苁蓉精纳米微粉干预后，细胞的存活率相对于模型组有显著的上升，模型组细胞内的α-synuclein以及磷酸化的GSK-3β、Tau蛋白的表达量均明显增高；而通过苁蓉精水提物或苁蓉精纳米微粉干预后，α-synuclein以及磷酸化的GSK-3β、Tau蛋白的表达量均明显降低，且苁蓉精纳米微粉的效果更好，其可能机制为苁蓉精水提物或苁蓉精纳米微粉干预模型组细胞后，α-synuclein的聚集减少，抑制了GSK-3β的活性，从而抑制了Tau蛋白的过度磷酸化，提高了细胞的存活率，起到神经保护的作用。

综上所述，本实验结果提示在神经保护以及PD的防治方面，苁蓉精纳米微粉较苁蓉精水提物具有较好的效果，为帕金森的防治提供了新的思路。本实验的不足之处是对高浓度药物配方的毒理作用没有进行进一步测试。中药的毒性对药物的治疗干预效果可能有一定的拮抗作用，因此未来应进行更深入的探索，以更好的发挥中药的优势。

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(本文编辑：邹晨双)

Effects of Congrongjing on the expression of GSK-3β protein after the injury of dopaminergic neurons induced by MPP+

QINWei，YEShuifen，FANWen，WEIWei，XUQian，CAIJing*.

*DepartmentofNeurology，CollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine，FuzhouFujian350122，China

Corresponding author：CAI Jing，Email：caij1@163.com

Objective To observe the effect of Congrongjing aqueous extract and Congrongjingnano-powders on the expression of Parkinson’s disease(PD)associated proteins,α-synuclein，GSK-3βand Tau in injured dopaminergic neurons induced by 1-methyl-4-phenyl-pyridinium(MPP+)and investigate the mechanism of Congrongjing in the treatment of PD. Methods Congrongjing aqueous extract and Congrongjing nano-powders dissolved by PBS medium were added into the culture medium and different concentrations of solution(100，200，250 μg/mL)were prepared. Then the PD model cells induced by MPP+were cultured by the above culture medium for 24 h，model control group(PD model cells were induced by MPP+，without intervention)and blank control group(MES23.5 cells without any treatment)were set up，MTT method was used to detect the cell survival rate，changes in expression of a-synuclein，GSK-3β and Tau protein in cells were determined by Western blot. Results Compared with the blank control group，the expression levels of α-synuclein protein，phosphorylation level of GSK-3β protein and Tau protein increased in the model control group，Congrongjing aqueous extract and Congrongjing nano-powders 100，200，250 μg/mL groups(P<0.01，P<0.05，respectively).Compared with the model control group，the expression levels of α-synuclein protein，phosphorylation level of GSK-3β protein and Tau protein decreased in the Congrongjing aqueous extract and Congrongjing nano-powders 100，200，250 μg/mL groups (P<0.01，P<0.05，respectively).Except for the phosphorylation level of GSK-3β protein between the Congrongjing aqueous extract 100 μg/mL groupand the Congrongjin gnano-powders 100 μg/mL group(P>0.05)，the expression levels of α-synuclein protein，phosphorylation level of GSK-3β protein and Tau protein of Congrongjing nano-powders groups were significantly lower than those of the Congrongjing aqueous extract group(P<0.01，P<0.05，respectively).Conclusions Congrongjing aqueous extract and Congrongjing nano-powders can reduce the injury of MES23.5 cells induced by MPP+and the effect of Congrongjing nano-powders is better. The mechanism may be related to reducing the accumulation of the α-synuclein and theactivity of GSK-3β, inhibiting the excessive phosphorylation of Tau protein.

Congrongjing aqueous extract；congrongjing nano-powders；Parkinson's disease；MES23.5 cells；neuroprotective

10.3969/j.issn.1006-2963.2016.06.007

国家卫生和计划生育委员会科研基金项目(WKJ-FJ-38)；福建省自然科学基金面上项目(2015J01686)；校管重点学科专项资助(X2014010-学科)

350122 福建中医药大学中西医结合研究院(覃威)；364000福建医科大学附属龙岩市第一医院老年病科(叶水芬)；361026 厦门市海沧医院综合内科(范雯)；441003湖北省襄阳市第四七七医院神经内科(魏维)；350122 福建中医药大学中西医结合学院(许茜、蔡晶)

蔡晶，Email：caij1@163.com

R742.5

A

1006-2963(2016)06-0415-06

2015-11-06)