狼疮性肾炎患儿血管损伤中心肌素与miR-145的表达情况及其临床意义研究

宁春艳，党西强，宋 芳，易著文，何小解



·论著·

狼疮性肾炎患儿血管损伤中心肌素与miR-145的表达情况及其临床意义研究

宁春艳，党西强，宋 芳，易著文，何小解

目的 观察狼疮性肾炎(LN)患儿血管损伤中心肌素与miR-145的表达情况，并探讨二者在LN患儿血管损伤发生中的作用。方法 选取2008年1月—2015年9月在湘雅二医院儿科住院的系统性红斑狼疮(SLE)患儿中确诊为LN的患儿49例，均行肾活检，活检组织常规进行免疫荧光、光镜及电镜检查。依据国际肾脏病协会(ISN)和肾脏病理学会(RPS)2002—2003年联合修订的ISN/RPS 2003 LN分型标准进行病理分型，共分为Ⅱ型5例、Ⅲ型7例、Ⅲ+Ⅴ型9例、Ⅳ型17例、Ⅳ+Ⅴ型11例。以中膜比例评价血管损害程度，并分为轻度14例、中度19例、重度16例。依据KATAFUCHI等的评价方法对肾小球、肾间质损害进行半定量积分；采用双抗体夹心法测定血清心肌素水平；采用原位杂交法检测miR-145表达。结果 不同病理分型患儿肾小球、肾间质损害积分间差异均有统计学意义(P<0.05)。肾小球损害积分与肾间质损害积分呈直线正相关(r=0.961，P<0.01)。不同血管损害程度、病理分型患儿血清心肌素水平间差异均有统计学意义(P<0.05)。不同血管损害程度、病理分型患儿肾内血管miR-145表达间差异均有统计学意义(P<0.05)。血清心肌素水平与肾内血管miR-145表达呈直线正相关(r=0.782，P<0.01)；血清心肌素水平、肾内血管miR-145表达与血管损害程度呈直线负相关(r值分别为-0.728、-0.790，P<0.01)。结论 随着血管损害程度的增加血清心肌素水平和肾内血管miR-145表达均降低，二者不仅可用于评估LN患儿肾内血管损害(RVLs)程度，也可能是LN肾血管损伤治疗的新靶点。

儿童；狼疮肾炎；血管损伤；心肌素；miR-145

宁春艳，党西强，宋芳，等.狼疮性肾炎患儿血管损伤中心肌素与miR-145的表达情况及其临床意义研究[J].中国全科医学，2016，19(31)：3831-3836.[www.chinagp.net]

NING C Y,DANG X Q,SONG F,et al.Expression of miR-145 and myocardin in vascular injuries of children with lupus nephritis and their clinical significance[J].Chinese General Practice，2016，19(31)：3831-3836.

本课题组前期在狼疮性肾炎(Lupus Nephritis,LN)儿童肾组织中发现，肾内血管中膜明显增厚，提示LN肾内存在血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cells,VSMCs)过度增殖，但其增殖的机制尚未明确[1]。研究表明，心肌素与心血管疾病的发生发展关系非常密切，VSMCs过度表达心肌素后，可明显激活VSMCs分化标志基因SM22α、SMα-MHC 、SMα-actin 等的表达，相反，抑制心肌素表达，可明显降低SM22α表达[2]；WEI等[3]研究发现，动脉粥样硬化时，miR-145表达下调；LOVREN等[4]对动脉粥样硬化小鼠应用慢病毒包装的miR-145治疗后，结果显示粥样硬化明显减轻、主动脉心肌素表达明显增高，提示心肌素可以促进上调miR-145表达，参与血管损伤与修复。那么在LN患儿血管损伤过程中，心肌素与miR-145的相互关系如何？目前罕见报道。为此，本研究以LN患儿为研究对象，系统观察LN患儿血管损伤过程中心肌素与miR-145的表达情况，探讨二者在LN患儿血管损伤发生中的作用，为LN血管损伤治疗提供新的靶点和理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2008年1月—2015年9月在湘雅二医院儿科住院的系统性红斑狼疮(SLE)患儿中确诊为LN的患儿49例，其中男11例，女38例；年龄3～16岁，平均年龄(8.4±2.1)岁。纳入标准：均符合SLE的诊断标准，且符合以下 3 项中的 1 项：(1)1 周内3次尿蛋白阳性或24 h尿蛋白>0.15 g/d或尿常规中可见异常管型(红细胞、白细胞、颗粒或混合管型)；

本文要点：

(1)狼疮性肾炎(LN)是指系统性红斑狼疮(SLE)合并双肾不同病理类型的免疫性损害，同时伴有明显肾脏损害临床表现的一种疾病；(2)LN患儿肾内血管损害(RVLs)主要表现为血管内膜脱落，中膜增厚；且中膜增厚程度愈高，内膜脱落程度与血管完整性缺失愈重；(3)随着血管损害程度的增加血清心肌素水平和肾内血管miR-145表达均降低，二者不仅可用于评估LN患儿RVLs程度，也可能是LN肾血管损伤治疗的新靶点。

(2)肾功能受累，即内生肌酐清除率<80 ml/min；(3)经肾活检证实[5]。排除标准：感染、肿瘤及其他结缔组织疾病。本研究经医院伦理委员会批准，患儿家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 病理分型 所有患儿均行肾活检，活检组织常规进行免疫荧光、光镜及电镜检查。同时依据国际肾脏病协会(ISN)和肾脏病理学会(RPS)2002—2003年联合修订的ISN/RPS 2003 LN分型标准进行病理分型[6]，共分为Ⅱ型5例、Ⅲ型7例、Ⅲ+Ⅴ型9例、Ⅳ型17例、Ⅳ+Ⅴ型11例。

1.2.1.1 肾脏病理损害评价 依据KATAFUCHI等[7]的评价方法对肾小球、肾间质损害进行半定量积分，选取每个患儿活检HE染色切片1张观察20个皮质区视野(×200)，根据肾小球内细胞增殖程度、肾小球局灶损害程度及球性硬化程度对肾小球损害程度进行评分。其中肾小球内细胞增殖程度评分：基本无细胞增殖1分、增殖<25% 2分、增殖25%～50% 3分、增殖>50% 4分；肾小球局灶损害程度评分：基本无局灶损害0分、损害<10% 1分、损害10%～25% 2分、损害26%～50% 3分、损害>50% 4分；球性硬化程度评分：基本正常0分、硬化<25% 1分、硬化26%～50% 2分、硬化51%～75% 3分、硬化>75% 4分。根据肾间质纤维化程度、炎性细胞浸润程度、肾小管扩张/萎缩程度对肾间质损害程度进行评分：基本正常0分、病变<10% 1分、病变10%～24% 2分、病变25%～50% 3分、病变51%～75% 4分、病变>75% 5分。综合20个视野评分得到各切片综合评分。

1.2.2 实验室检查 患儿均进行血常规、凝血功能、肝功能(清蛋白、球蛋白)、血脂全套、肾功能(尿素氮、肌酐、尿酸)、尿沉渣、24 h尿蛋白定量等常规检查。采用双抗体夹心法测定血清心肌素水平，试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司，具体操作严格按试剂盒说明书进行。

1.2.3 miR-145原位杂交及表达量检测 探针序列为CTGGGAAAACTGGACCGTGAGG，购自长沙艾佳生物科技有限公司。肾活检组织石蜡切片、厚度2～3 μm，脱蜡后置入3%过氧化氢(H2O2)室温10 min，3%枸橼酸新鲜稀释的胃蛋白酶37 ℃消化30 min，然后滴加预杂交液，37 ℃预杂交2 h后，加入稀释好的杂交探针混合液(1∶500)，37 ℃杂交过夜。洗涤干燥后滴加封闭液，37 ℃ 30 min，直接滴加生物素化鼠抗地高辛，37 ℃ 60 min，加链霉亲和素-生物素复合物(SABC)37 ℃下30 min，洗涤干燥后,滴加生物素化过氧化物酶37 ℃ 30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封固。200倍及400倍视野下观察miR-145表达特点并拍照。使用医学图像分析系统测量miR-145阳性面积及阳性区域的平均灰度。

2 结果

2.1 49例LN患儿病理分型及其临床特征 49例LN患儿中，Ⅱ型占10.2%，Ⅲ型占14.3%，Ⅲ+Ⅴ型占18.4%，Ⅳ型占34.7%，Ⅳ+Ⅴ型占22.5%，各病理分型的临床特征见表1。

2.2 不同病理分型患儿肾小球、肾间质损害积分比较 不同病理分型患儿肾小球、肾间质损害积分间差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。肾小球损害积分与肾间质损害积分呈直线正相关(r=0.961，P<0.01)。

表1 49例LN患儿病理分型及其临床特征(例)Table 1 Pathological types and clinical features of 49 children with LN

表2 不同病理分型患儿肾小球、肾间质损害积分比较，分)Table 2 Comparison of glomerular damage and renal interstitial injury scores of children with different pathological types

2.3 不同血管损害程度患儿血管测量指标比较 49例LN患儿平均血管损害程度为(0.65±0.11)，主要表现为血管内膜脱落，中膜增厚。中膜增厚程度愈高，内膜脱落程度与血管完整性缺失愈重，且血管中膜增厚严重程度与血管损害严重程度一致，其中尤以Ⅳ型及Ⅳ+Ⅴ型明显。Ⅱ型LN患儿肾内血管内膜较完整，血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)增生明显；Ⅲ型及Ⅲ+Ⅴ型部分内膜出现破坏，但可见部分内膜不对称增生、中膜增厚轻重不一；Ⅳ型及Ⅳ+Ⅴ型内膜破坏严重，管腔可见脱落的VECs并严重狭窄，中膜增生明显，VSMCs多数表现为纺锤形(见图1)。5例Ⅱ型患儿中，4例血管损害程度为轻度、1例为中度，Ⅲ型及Ⅲ+Ⅴ型患儿血管损害程度均为中度，Ⅳ型及Ⅳ+Ⅴ型患儿内膜脱落明显，血管损害程度为重度。不同肾小球损害程度患儿管壁厚度/血管外径、内膜厚度/血管外径、中膜厚度/血管外径间差异均有统计学意义(P<0.05，见表3)。管壁厚度/血管外径与肾小球、肾间质损害积分均呈直线正相关(r值分别为0.721、0.658，P<0.01)。

表3 不同血管损害程度患儿血管测量指标比较Table 3 Comparison of blood vessel measurement indexes of children with different degrees of vascular injury

2.4 不同血管损害程度、病理分型患儿血清心肌素水平比较 不同血管损害程度患儿血清心肌素水平间差异有统计学意义(P<0.05，见表4)。不同病理分型患儿血清心肌素水平间差异亦有统计学意义(P<0.05，见表5)。

2.5 不同血管损害程度、病理分型患儿miR-145表达比较 根据不同的肾脏病理分型，取形态一致的肾内血管，比较其miR-145表达差异。miR-145主要表达于血管和肾小管，肾小管中主要表达于近曲小管的上皮细胞，肾内血管主要表达于VSMCs，血管管径越大，miR-145表达相对越多(见图2)。不同血管损害程度患儿肾内血管miR-145表达间差异有统计学意义(P<0.05，见表6)。不同病理分型患儿肾内血管miR-145表达间差异亦有统计学意义(P<0.05，见表7)。血清心肌素水平与肾内血管miR-145表达呈直线正相关(r=0.782，P<0.01)；血清心肌素水平、肾内血管miR-145表达与血管损害程度呈直线负相关(r值分别为-0.728、-0.790，P<0.01)。

表4 不同血管损害程度患儿血清心肌素水平比较Table 4 Comparison of serum myocardial level among children with different degrees of vascular injury

表5 不同病理分型患儿血清心肌素水平比较Table 5 Comparison of serum myocardin level among children with different pathological types

注：A为Ⅱ型，B为Ⅲ型，C为Ⅲ+Ⅴ型，D为Ⅳ型，E为Ⅳ+Ⅴ型；PAS染色=过碘酸-雪夫染色

图1 不同病理分型患儿血管损害情况(PAS染色，×400)

Figure 1 Vascular injury of children with different pathological types

注：A为大管径血管(HE染色×200)；B为中等管径血管(HE染色×400)；C为小管径血管(HE染色×400)

图2 不同管径肾内血管miR-145表达情况

Figure 2 miR-145 expression in renal vessels of different pipe diameters

表6 不同血管损害程度患儿肾内血管miR-145表达比较Table 6 Comparison of miR-145 expression in renal vessels of children with different degrees of vascular injuries

表7 不同病理分型患儿肾内血管miR-145表达比较Table 7 Comparison of miR-145 expression in renal vessels of children with different pathological types

3 讨论

SLE患者是心血管疾病，尤其是动脉粥样硬化的高危人群[9]，其冠状动脉病变的发生率是普通人群的数倍[10-11]。事实上，当患者诊断SLE不久，即出现轻重不等的大、小血管的功能障碍和损害[12]。SLE患者中有45%～85%临床表现为LN及肾内血管损害(RVLs)[13-14]。RVLs可进一步促进、加重慢性LN进展，形成恶性循环。因此，充分了解LN患者RVLs病变情况及可能的发生机制，具有极其重要的临床意义。

本研究中49例SLE住院患儿肾活检均发现轻重不一的肾脏损害，其中Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型共28例(57.1%)，说明儿童LN病理损害较重，这可能也是儿童LN较成人临床表现更严重、预后更差的原因之一；本研究中LN患儿肾小球损害评分与其病理分型保持一致，与目前多以肾小球受损的描述诊断作为主要分型依据相符合；49例LN患儿均存在不同程度的血管内膜脱落或中膜增厚，且随着中膜增厚程度越重，血管内膜脱落程度也愈重，血管完整性缺失也随之加重，由此可见，血管中膜增厚程度在一定程度上可用于评价RVLs病变程度。因此，若在目前LN病理诊断中应加入肾间质血管损害评估，将对LN患儿病情及治疗指导更具意义。

血管损伤后主要有2个修复过程：内皮再生修复内膜和平滑肌增殖迁移形成新生内膜，修复的最终效果主要取决于这2 种修复方式之间的动态平衡。正常情况下，血管壁中膜的VSMCs呈分化表型，也称收缩表型，表达SMα-actin、SM-MHC和SM22α等平滑肌特异的收缩蛋白；当血管受到损伤因素刺激时，VSMCs可从收缩表型转化为合成表型并获得增殖能力，同时VSMCs特异收缩蛋白的表达被抑制。血管生理的多项研究表明VSMCs可以很大限度地在合成表型和收缩表型间转换，在VSMCs过度表达心肌素后,可明显激活VSMCs分化标志基因如SM22α、SMα-MHC 和SMα-actin 等的表达[3]，相反，过度表达心肌素显性负性突变体或心肌素siRNA后,可明显降低SM22α表达，表明心肌素是调节此种转换的关键蛋白[15]。本研究结果显示，血管中、重度损害患儿外周血心肌素水平明显低于血管轻度损害患儿；Ⅱ型患儿外周血心肌素水平最高，Ⅲ、Ⅲ+Ⅴ、Ⅳ、 Ⅳ+Ⅴ型患儿外周血心肌素水平依次降低，说明LN患儿外周血心肌素水平越低，RVLs则越重，进而提示检测LN患儿外周血心肌素水平可能是一种评估其RVLs程度的新指标。

2009年，CORDES等[16]发现miR-145在鼠胚胎向VSMCs分化的过程中必不可少，同时证实心肌素可以激活miR-145的表达，而miR-145的3′URT可直接结合心肌素而促进VSMCs分化，提示心肌素可通过上调miR-145表达，参与血管损伤与修复。WEI等[3]研究发现miR-145在动脉粥样硬化表达下调；LOVREN等[4]研究发现应用miR-145可通过上调主动脉心肌素表达明显减轻粥样硬化，这启示若能为VSMCs提供充足的miR-145基因，将能减缓甚至逆转血管性疾病。以上研究发现，血管损害越重，血管平滑肌中miR-145基因表达越低，本研究相关分析发现，血清心肌素水平与血管中miR-145表达呈直线正相关，血清心肌素水平、血管中miR-145表达与血管损害程度则呈直线负相关，说明miR-145基因也可能是LN肾血管损伤的标志物及血管损害治疗的一个新靶点。但miR-145基因表达下调是否由心肌素下降所致？还需进一步研究。

综上所述，LN患儿存在不同程度的RVLs，血清心肌素水平与肾内血管miR-145表达与血管损害程度呈直线负相关，LN患儿血清心肌素水平与肾内血管miR-145表达不仅可用于评估LN患儿RVLs程度，也可能是LN肾血管损伤治疗的新靶点。但miR-145与心肌素相互作用在LN血管损害发生与发展中的机制尚有待于进一步研究。

作者贡献：宁春艳负责病理统计分析、心肌素检测；党西强、宋芳负责临床病例收集；易著文负责技术指导；何小解为项目负责人，负责论文设计与写作。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：崔沙沙)

Expression of miR-145 and Myocardin in Vascular Injuries of Children with Lupus Nephritis and Their Clinical Significance

NINGChun-yan,DANGXi-qiang,SONGFang,YIZhu-wen,HEXiao-jie.

LaboratoryofPediatricNephropathy,theSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity;DepartmentofPediatrics,theThirdHospitalofChangsha,Changsha410011,China

HEXiao-jie,LaboratoryofPediatricNephropathy,theSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410011,China;E-mail:hexj7150@163.com

Objective To examine the expression of miR145 and myocardin in vascular injuries of children with lupus nephritis(LN),and to discuss their roles in the development of vascular injuries of LN children.Methods 49 systemic lupus erythematosus(SLE) inpatients who were diagnosed with LN in the Department of Pediatrics in the Second Xiangya Hospital from January 2008 to September 2015 were enrolled in this study.All patients underwent renal biopsy.Immunofluorescence,light microscopic and electron microscopic examination were given to biopsy tissues routinely.According to 2002—2003 typing criteria of LN that jointly revised by International Society of Nephrology(ISN)/Renal Pathology Society(RPS),pathological typing was conducted,and there were 5 cases in type Ⅱ,7 in type Ⅲ,9 in type Ⅲ+Ⅴ,17 in type Ⅳ and 11 in type Ⅳ+Ⅴ.The degree of vascular injury was evaluated by the proportion of tunica media,and the subjects were divided into 14 mild cases,19 moderate cases,and 16 severe cases.According to KATAFUCHI and other methods of evaluation,semi-quantitative scores of glomerular damage and renal interstitial injury were made;the level of serum myocardin was measured by double antibody sandwich method;and the expression of miR-145 was detected by in situ hybridization method.Results There were significant differences in the scores of glomerular damage and renal interstitial injury among children of different pathological types(P<0.05).There was a positive linear correlation between the score of glomerular damage and the score of renal interstitial injury(r=0.961,P<0.01).The level of serum myocardin was significantly different between children with different vascular injury degrees and pathological types(P<0.05).The expression of miR-145 in renal blood vessels was significantly different between children with different vascular injury degrees and pathological types(P<0.05).There was a positive linear correlation between the level of serum myocardin and the expression of miR-145 in renal blood vessels(r=0.782,P<0.01);and the level of serum myocardin and the expression of miR-145 in renal blood vessels were negatively correlated with the degree of vascular injuries(values ofrwere -0.728,and -0.790 respectively;P<0.01).Conclusion With the increase of the degree of vascular injuries,the level of serum myocardin and the expression of miR-145 in renal blood vessels were both decreased,the two can not only be used to assess the degree of renal vascular lesions(RVLs) of children with LN,but also may be a new target for the treatment of renal vascular injury in LN.

Child;Lupus nephritis;Vascular injury;Myocardin;miR-145

国家自然科学基金资助项目(30500546)

410011湖南省长沙市，中南大学湘雅二医院儿童肾脏病研究室(宁春艳，党西强，易著文，何小解)；长沙市第三医院儿科(宁春艳，宋芳)

何小解，410011湖南省长沙市，中南大学湘雅二医院儿童肾脏病研究室；E-mail：hexj7150@163.com

R 593.242

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.31.015

2016-05-07；

2016-09-22)