印度谷螟18SrDNA的克隆及定量PCR方法的建立

唐培安 吴海晶 薛 昊 孔德英 宋 伟

印度谷螟18SrDNA的克隆及定量PCR方法的建立

唐培安1吴海晶1薛 昊1孔德英2宋 伟1

（南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心1，南京 210023）
（重庆出入境检验检疫局2，重庆 400020）

利用分子生物学方法从印度谷螟幼虫体内克隆获得了18S rDNA的基因全长序列（1 888 bp，GenBank登录号为KJ836335）。利用邻位连接法（neighbor-joining）分别构建了基于18S rDNA基因全长、保守序列II以及多变区的系统发育树，比较了与其他已知昆虫18SrDNA基因的同源性和遗传距离。与其他序列的系统发育树相比，其全长序列的系统发育树更能反映鳞翅目昆虫的亲缘关系，印度谷螟与大蜡螟的亲缘关系最近。此外，建立了以18SrDNA为内参基因的实时荧光定量PCR方法。

印度谷螟 18SrDNA 系统发育树 实时荧光定量PCR

核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）是生物体中核糖核酸（RNA）的一类，为核糖体的主要组成部分，其功能为提供tRNA与mRNA密码子对应的环境，从而完成蛋白质的合成［1］。核糖体由1个大亚基和1个小亚基构成，在真核生物核糖体的小亚基中含有1个沉降系数为18S的RNA，该RNA由染色体基因编码，称为18SrDNA 基因，长度约为1 800 bp［2］。在生物的进化过程中非常保守，是研究生物高级分类群系统演化的难得工具之一［3］。另外，18SrDNA基因在生物体内的表达水平相对稳定，可作为内参基因广泛应用于基因表达研究中，是应用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR）技术进行基因的相对定量检测时常用的内参基因之一［4-7］。

印度谷螟Plodia interpunctella （Hübener）隶属于鳞翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae），是一种世界性储粮害虫，我国华北及东北地区受其危害尤其严重。主要以幼虫为害各种谷物豆类、花生、干果、奶粉、中药材、烟叶等，常吐丝连缀粮粒及排泄物，并结网封闭其表面，使其结块变质，大量发生时还可引起粮食发热，对储藏物的安全构成严重威胁。然而，目前还未见有对印度谷螟18S rDNA基因及相关信息的研究报道，因此本研究利用分子生物学技术克隆获得了印度谷螟18SrDNA基因的全长序列，分析了利用18SrDNA基因序列构建系统发育树的最适片段，探讨了在低级分类阶元中应用的可能性，并以此基因为内参基因建立了实时荧光定量PCR方法，对印度谷螟相关功能基因表达水平分析研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试昆虫

供试昆虫印度谷螟采自南京财经大学粮食储运国家工程实验室的模拟粮仓中，并在养虫室内人工饲养数代。饲料为磨碎的稻谷颗粒，培养在温度为（28±1）℃、湿度为（75±5）%、24 h无光照条件的恒温恒湿培养箱中。

1.1.2 主要仪器与试剂

ABI 7500实时荧光定量PCR仪、veriti梯度PCR仪：美国应用生物系统公司；PQX型分段可编程人工气候箱：宁波东南仪器有限公司；DP304基因组提取试剂盒：天根生化科技有限公司；zero cloning载体：北京全式金生物技术有限公司；DL2000 Marker、rTaq DNA聚合酶、DH5α感受态细胞、胶回收试剂盒、SYBR Premix Ex Taq：宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 的提取

以印度谷螟三龄幼虫为材料，按照DNA提取试剂盒说明书的操作步骤，提取基因组DNA。

1.2.2 引物设计

从GenBank数据库中搜索印度谷螟近缘物种的18SrDNA基因序列，用DNAMAN软件进行多重比对，找出保守序列，并据此保守序列设计扩增引物：

上游引物P1：TCACCTACGGAAACCTTGT

下游引物P2：ACCTGGTTGATCCTGCCAGT

根据克隆获得的印度谷螟18S rDNA基因序列，使用Primer 3.0 在线引物设计软件（http：／／Frodo.wi.mit.edu／primer3／）设计real-time PCR 引物，其序列如下：

上游引物R1：TTCACCGACGATATGCTCCG

下游引物R2：ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG

以上引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR反应及产物的克隆及测序

以印度谷螟基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增后，产物经琼脂糖凝胶电泳、EB染色后，利用胶回收试剂盒对目的电泳条带进行回收纯化，纯化产物克隆到zero cloning质粒载体中，再转化进入DH5α感受态细胞内，在含有氨苄青霉素AMP的LB固体培养基中培养12 h（37℃），随机挑选阳性菌落，在LB液体培养基中扩大培养，经PCR扩增检测后送公司测序，测序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2.4 序列及遗传信息分析

从GenBank中下载鳞翅目、鞘翅目、毛翅目和长翅目中不同科昆虫的18SrDNA基因序列（表1），结合本研究所得到的印度谷螟18S rDNA基因序列，用MegAlign进行多重序列比对和同源性分析，选取不同的核苷酸片段用MEGA6.0软件分析其遗传距离和亲缘关系，并采用邻位连接法（NJ）构建系统进化树。其中的分支置信度由1 000次自举法（Bootstrap）检验。

1.2.5 实时荧光定量PCR条件的优化

采用SYBR Green I染料法，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，数据分析采用系统自带的软件7500 software 2.0.5进行，以最小的Ct值和最高的荧光值为标准，分别对循环条件、退火温度、引物浓度进行优化。

1.2.6 熔解曲线分析

为排除引物二聚体或非特异性扩增对定量结果造成影响的可能性，在PCR扩增后进行熔解曲线分析，以确定产物为单一的目的产物。温度以0.5℃／10 s的速度从60℃缓慢递增到95℃，连续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线。

1.2.7 标准品的制备及标准曲线的建立

以印度谷螟基因组为模板，利用上述定量PCR引物进行常规PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳、EB染色后，利用胶回收试剂盒对目的电泳条带进行回收纯化。对纯化的片段进行10倍系列梯度稀释，以优化的反应条件进行实时荧光定量PCR扩增。以模板的相对浓度为横坐标，以Ct值为纵坐标建立相对定量标准曲线。

2 结果与分析

2.1 印度谷螟18SrDNA基因的克隆与序列分析

以印度谷螟基因组DNA为模板，利用引物P1和P2进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳并染色后，获得一条目的基因片段（图1），经基因克隆后进行基因序列测定，得到结果见图2，该基因全长为1 888 bp，基因中T、C、A、G各碱基个数占基因总数的比例分别为25.0%、22.8%、24.8% 和27.4%，G+C 个数占基因总数的比例为50.2%，碱基组成基本无偏异（GenBank登录号为KJ836335）。

表1 昆虫的18SrDNA基因序列数据来源

图1 印度谷螟18SrDNA基因PCR扩增结果

2.2 基因同源性和遗传距离

印度谷螟与其他13种昆虫18S rDNA基因序列的同源性以及两两间的遗传距离见表2。鳞翅目的8种昆虫18S rDNA全序列的遗传距离介于0.003～0.018之间，同源性达98%以上，印度谷螟与鹿纹天蚕蛾Hemileuca sp．和大蜡螟Galleria mellonella的同源性最高，分别为99.14%和98.97%；而不同目之间昆虫的同源性相对较低，均低于90%，且遗传距离较远，均大于0.12。说明18SrDNA基因具有较高的保守性，并与物种的进化关系具有较高的一致性，可以作为分类学中系统进化分析的重要参考依据。

图2 印度谷螟18SrDNA基因核苷酸序列

表2 昆虫18SrDNA序列的同源性（上三角，%）和两两间的遗传距离（下三角）

2.3 基因同源区和多变区

通过多重序列比对分析，共得到2 104个碱基排列位点，其中保守碱基位点有1 558个，可变碱基位点480个，简约信息位点354个，单碱基变化位点105个。分析结果表明，昆虫18S rDNA在不同区段保守性不同，一般包含4个保守程度较高同源区（保守序列Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）（图3）。其中，保守序列Ⅱ的长度为395 bp，相当于印度谷螟18S rDNA第265至660 bp区域，其插入和缺失序列最少，保守性最强。

图3 印度谷螟18SrDNA同源区和多变区的分布

2.4 系统发育关系分析

利用MEGA6.0软件采用邻位连接法（NJ），经过全局重排，采用Kimura-2参数碱基替代模型，靴带检验（Bootstrap test）设定重复值为1 000，分别构建14种昆虫18SrDNA基因全长、保守序列Ⅱ以及多变区的系统发育树（图4）。

在本研究所建立的所有系统发育树中，鳞翅目与其他目以较高的置信度完全分开，而鳞翅目内部的拓扑结构在不同的系统发育树中略有不同。从图4可以看出3个系统树之间的差异主要在树的基部，不同发育树上鳞翅目被分成了5～6个分支。将鳞翅目分成5个分支的是基于18S rDNA全序列和保守序列Ⅱ构建的发育树，其结果与传统分类最为接近。将鳞翅目分成6支的是基于多变区构建的发育树，本研究构建系统进化树使用的多变区为保守序列Ⅱ与保守序列Ⅲ之间的区域（序列长度为136 bp），结果显示，6个分支中仅分出了毒蛾科和凤蝶科两支，其余科昆虫均未能很好聚类，与传统分类明显不符。

图4 基于昆虫18SrDNA基因的系统发育树

2.5 标准曲线的制作

以Ct值为纵坐标，以模板浓度的对数为横坐标，获得相对定量标准曲线（图5）。结果表明，本方法有很好的相关性，其Ct值与模板浓度的回归方程为Y ＝ -2.958x+18.113，Y 为Ct值，x为模板浓度，其相关系数为0.998，扩增效率为117.8%。

图5 18SrDNA的标准曲线

2.6 扩增产物的熔解曲线

扩增产物的熔解曲线只有1个特异峰（图6），表明产物是唯一的，无引物二聚体或非特异性扩增产物，说明本试验设计的定量PCR引物具有很好的特异性，PCR反应条件得到了较好的优化。

图6 熔解曲线分析

3 讨论与结论

3.1 18SrDNA系统进化分析

18SrDNA在蛋白质合成中具有重要的功能，且其基因序列及二级结构高度保守，所以被广泛应用于研究分子系统学及物种的分类鉴定［8-9］。本研究构建的系统发育关系与传统分类基本一致，进一步证明了18SrDNA在昆虫纲中具有适中的保守性，可以用于昆虫分类研究。然而，普遍认为18S rDNA可用于科以上水平的系统发育分析［10-11］。本研究分析获得的3个系统发育树也证明高阶元分类与传统分类学接近，而低阶元聚类结果则存在较大差异。故18SrDNA只能用于纲目等高级阶元间关系的研究，而由其获得的总科以下阶元间的关系并不可靠。18SrDNA的全长序列还是其中的某一段序列更适合？本论文的研究结果表明，基于多变区构建的发育树与传统分类学存在明显的差异，而全长序列发育树和保守序列Ⅱ发育树则更能反映昆虫的亲缘关系，这与大部分人的研究结论一致［12-17］。虽然18SrDNA的全长序列包含了更多的信息，但是保守序列Ⅱ具有碱基数量少、易于扩增和测序，更适于大规模的分类学研究。据此，建议选择昆虫18SrDNA中较短的保守序列Ⅱ代替全长构建系统发育树。

3.2 18S rDNA作为内参基因的定量PCR方法的建立

实时荧光定量PCR技术具有高度的敏感性、特异性，且能对模板进行精确的量化，受到科学家的广泛关注。借助实时荧光定量PCR技术，可以对昆虫不同品系、不同组织或不同个体间的基因表达水平进行比较研究，从分子水平上探究昆虫的生命活动过程［18-20］。本研究利用18S rDNA作为内参基因，初步探索建立了以印度谷螟18SrDNA为内参基因的基于SYBR Green染料技术的实时荧光定量PCR方法。本研究设计的定量PCR引物具有较好的特异性，建立的方法具有快速、高通量、线性范围广等特点，为18S rDNA作为内参基因对印度谷螟相关基因的实时荧光定量PCR分析提供了有利的方法学基础。

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Cloning of the 18SrDNA and Establishment of Quantitative Real-Time PCR Plodia interpunctella

Tang Peian1Wu Haijing1Xue Hao1Kong Deying2Song Wei1
（College of Food Science and Engineering／Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety，Nanjing University of Finance and Economics1，Nanjing 210023）
（Chongqing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau2，Chongqing 400020）

The full-length sequence of 18SrDNA gene （1 888 bp，GenBank accession number：KJ836335）was obtained by cloning from the Plodia interpunctella larva using molecular biology method in this paper.The neighbor joining method was used to construct phylogenetic trees based on full-length sequence，conservative sequenceⅡand the variable area of 18SrDNA gene respectively，comparing the homology and genetic distance with 18S rDNA gene of other known insects.The phylogenetic tree based on the full-length sequence can better reflect the genetic relationship of Lepidoptera insects compared with that based on the other sequences，Plodia interpunctella has the closest genetic relationship with the Galleria mellonella．In addition，the quantitative real-time PCR method was established with 18SrDNA as a reference gene.

Plodia interpunctella，18SrDNA，phylogenetic tree，quantitative real-time PCR

Q751

A

1003-0174（2016）11-0099-07

粮食公益性行业科研专项（201413007-2，201513002-5），江苏高校优势学科建设工程（JSYXK201403）

2015-03-25

唐培安，男，1981年出生，副教授，粮食储藏