一种囊状幼虫病毒分子标记的克隆

熊翠玲林跃文梁勤郑燕珍徐细建张曌南黄枳腱郭睿陈大福

（1福建农林大学蜂学学院，福州350002；2龙田跃文蜂业专业合作社，泉州362114）

一种囊状幼虫病毒分子标记的克隆

熊翠玲1林跃文2梁勤1郑燕珍1徐细建1张曌南1黄枳腱1郭睿1陈大福1

（1福建农林大学蜂学学院，福州350002；2龙田跃文蜂业专业合作社，泉州362114）

蜜蜂囊状幼虫病是由囊状幼虫病毒（Sacbrood virus，SBV）侵染蜜蜂幼虫而导致的一种致死性病毒病。本研究根据GeneBank上SBV多个毒株的基因组信息设计合成一对特异性引物，从出现囊状幼虫病典型症状的中蜂幼虫中扩增出一个大小约为106 bp的特异性SBV106片段，进而将其克隆进pGEM-T载体，经蓝白斑筛选出阳性质粒，EcoRⅠ酶切可得约106 bp大小的目的片段，阳性质粒原菌液测序结果显示该片段与SBV全序列（收录号：AF092924）的相似度达100%，证明该序列为SBV特有序列。上述结果表明SBV106片段可作为检测蜜蜂囊状幼虫病的分子标记，应用于养蜂生产。

囊状幼虫病毒；分子标记；PCR；克隆

1 引言

蜜蜂是社会学模式昆虫，也是一种重要的授粉昆虫，对全球农业生产有着至关重要的作用[1]。中华蜜蜂（Apis cerana cerana）（简称中蜂）特指我国的土著蜂[2]，与意大利蜜蜂（Apis mellifera Ligustica）（简称意蜂）相比，中蜂相对勤奋、敏捷、适应性强、嗅觉更灵敏，善于发现和利用零星蜜源，抗逆性强，表现为冬季更较耐寒，夏季较耐热，而且中蜂抵抗螨虫、美洲幼虫腐臭病、白垩病的能力比意蜂强，不足是抵抗巢虫的能力较差，清理能力差，喜欢新的巢脾，常啃咬旧巢脾，蜂王的产卵能力不及意蜂王，春季和秋季容易分蜂，还容易迷巢，易发生盗蜂，多数蜂群群势较弱，产浆量极低[3-5]。

囊状幼虫病毒是由囊状幼虫病毒（Sacbrood virus，SBV）侵染蜜蜂引起的疾病，早在1913年就见诸报道[6]。SBV是传播最广的蜜蜂病毒之一，传染性极强[7]，对世界各地蜜蜂的健康造成极大危害，自从1913年美国首次鉴定[8]后，在各个大洲都有发现[6,9-11]，是第一个被鉴定的蜜蜂幼虫病毒[8]，也是第一个全基因组测序的蜜蜂病毒[12]，该病毒为单链正义RNA[13]，属于小RNA病毒科，无囊膜，外形无特征，含有4个结构蛋白[14]。

目前有多种分子生物学方法可以定性检测SBV，如：RT-PCR[15]，Nest-PCR[16]，免疫扩散技术，酶联免疫法，电子显微镜镜检，Western Blotting[17]，实时荧光定量PCR[18]，环介导等温扩增技术（LAMP）[19]。本研究根据Genbank中SBV全序列保守区段设计特异性引物，通过对患囊状幼虫病的中蜂幼虫进行PCR扩增获得特异性分子标记，然后将其克隆至pGEM-T载体，进而在不同来源的患病幼虫上验证该分子标记的特异性，为下一步实时荧光定量PCR提供目的基因。

2 材料与方法

2.1材料

出现囊状幼虫病典型症状的中蜂幼虫，分别采自福建农林大学蜂学学院教学实验蜂场、福建省福州市晋安区寿山乡蜂场和湖北省钟祥市蜂场。

2.2方法

2.2.1 患病幼虫总RNA提取与cDNA合成

取2只患病中蜂幼虫放入1.5 mL EP管中，充分研磨，根据RNA抽提试剂盒（TaKaRa公司，日本）说明书提取研磨样品总RNA。为排除无关DNA的污染，使后续实验不受干扰，用无Rnase的Dnase I（TaKaRa公司，日本）处理上述RNA，然后按照cDNA合成试剂盒（Promega公司，美国）说明书将经处理的RNA反转录为相应cDNA。

2.2.2 目的基因的扩增及克隆

参照GenBank中SBV多个毒株的基因组序列，利用DNAman软件（LynnonBiosoft公司，美国）在病毒序列保守区设计一对特异性引物，SBV106F：5’-AGGATTGGTTGGTTGCGAAGTT-3’，SBV106R：5-CCTACCTCAGCGTCGTACATTC-3’。同时选择基因βactin作为内参基因，其引物序列参照已有文献报道[12]（β-actinF：5’-TGCCAACACTGTCCTTTCTG-3’，β-actinR：5’-AGAATTGACCCACCAATCCA-3’）。引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

以反转录得到的cDNA为模板，分别以上述引物对SBV106分子标记和β-actin进行PCR扩增，反应程序：95℃预变性5 min，95℃变性30 s、57℃退火30 s、72℃延伸30 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物用1.5%（W/V）的琼脂糖凝胶进行电泳30 min，EB染色8 min，并用凝胶成像系统（培清科技有限公司，中国）进行拍照。利用胶回收试剂盒（Axygen公司，美国）纯化SBV106分子标记对应的DNA片段，然后连接pGEM-T载体（Promega公司，美国），转化大肠杆菌感受态细胞，利用蓝白斑筛选阳性质粒。利用质粒抽提试剂盒（Axygen公司，美国）抽提菌液中的阳性质粒，利用限制性内切酶EcoRⅠ（TaKaRa公司，日本）对其进行酶切鉴定，酶切鉴定为阳性的质粒原菌液送上海生工测序，测序结果用序列分析软件进行分析，并在NCBI中进行Blast序列比对。

2.2.3 SBV分子标记的验证

取-20℃保存的采自湖北钟祥市中蜂场的患病幼虫3～5只，福建农林大学蜂学学院实验蜂场病群明显发病幼虫3～5只，无症状小幼虫3～5只，3个上年有发病但今年未发病的蜂群各取大幼虫3～5只，健康蜂群大幼虫4只，分别放在1.5 mL EP管中进行研磨，提取RNA，反转录为cDNA，之后以引物SBV106F/R进行PCR检测。

3 结果与分析

3.1 SBV106片段的扩增

以患病幼虫cDNA为模板，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，扩增出一条大小约为106 bp的特异性片段（图1），而以无菌水作为模板的空白对照，PCR结果呈阴，说明该分子标记可检测出患病幼虫体内SBV的存在。

图1 SBV目的基因的PCR扩增

3.2重组质粒的酶切鉴定

将蓝白斑筛选出的白色单斑转化培养的菌液抽提质粒，继而用EcoRⅠ对其进行酶切鉴定，酶切产物的电泳结果显示，有3个重组质粒能酶切得到SBV目的片段（图2），表明SBV目的片段被成功克隆进pGEMT载体。

图2 重组质粒的酶切鉴定

3.3目的基因的测序与分析

将酶切鉴定为阳性的质粒对应菌液送生工测序，利用Research序列处理软件进行序列分析，找出引物序列，确定目的基因片段，测序结果表明所克隆的SBV106片段长度为106 bp（图3），将该序列与Genbank收录SBV全序列（收录号：AF092924）进行比对，相似度达100%（图4），证明该序列为SBV特有序列，可以作为检测蜜蜂囊状幼虫病的分子标记。同时也说明本研究所检测病毒为SBV，可以作为后续研究的材料。

图3 SBV106片段测序结果

图4 SBV106片段序列的Blast比对结果

3.4 SBV分子标记应用性检测

将蜂场采集的中蜂幼虫样品经引物SBV106F/R进行PCR检测，结果显示有明显囊状幼虫病症状的幼虫样品检测结果均呈阳性，发病蜂群的无症状幼虫检测呈阳性，曾发病蜂群的无症状幼虫部分为阳性，取自从未发病的健康蜂群的幼虫检测结果均呈阴性（图5）。上述结果说明，应用该SBV分子标记检测蜜蜂幼虫样品，能准确检测出患病幼虫均呈SBV阳性，而在无症状幼虫样品中，也能检测出部分样品呈SBV阳性。

图5 不同蜂场中蜂幼虫样本的PCR检测结果

4 讨论

由于中华蜜蜂病毒多为RNA病毒，纯种毒株目前无法获得，且蜜蜂通常是同时携带多种病毒，难以取得携带单一病毒的虫体，所以本试验中未进行该分子标记的特异性验证。引物设计本身要求特异性，必须在cDNA保守区内，通过测序以及与数据库中SBV全序列比对发现该分子标记克隆基因能达到100%相似度。并且荧光定量反应过程中，如果有非特异性扩增，熔解曲线会出现非特异峰，只有单一峰基本可以确定该分子标记的特异性。

由于病虫样本有限，故分子标记应用性所检测样本偏少，可在蜜蜂病毒病爆发时进一步对该分子标记的应用性、特异性进行测定。病群中所有有症状幼虫检测结果呈阳性，且SBV条带亮度很高，说明幼虫蜕皮液中含有大量SBV导致其发病死亡。上年患病群检测结果部分呈阳性、部分呈阴性表明SBV仍然存在于蜂群中部分幼虫体内，呈潜伏状态，蜂群并未表现出明显发病症状。

健康蜂群中蜜蜂幼虫样品病毒检测结果呈阴性可能是由于实验操作上出现问题所致，可用内参β-actin验证。如果β-actin条带呈阳性，说明实验操作无问题，病毒呈阴性是由于样品中确实不含SBV；如果β-actin条带呈阴性，表明实验操作有问题，应重新提取RNA并进行反转录；或是由于样品本身不含SBV也会使检测结果呈阴性；也可能是因为样品含SBV量极低，达不到本研究PCR检测极限浓度，所以检测结果呈阴性。

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Cloning of a kind of molecular marker for Sacbrood virus

Xiong Cuiling1,Lin Yuewen2,Liang Qin1,Zheng Yanzhen1,Xu Xijian1,Zhang Zhaonan1, Huang Zhijian1,Guo Rui1,Chen Dafu1
(1 College of Bee Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002;2 Longtianyuewen Professional Corporation for Apiculture,Quanzhou 362114)

Sacbrood is a kind of fatal disease for honeybee larvae caused by SBV.In this study,a pair of primers was designed according to genome information of several SBV strains published in GeneBank.A specific fragment about 106 bp was amplified from Apis cerana cerana larvae with obvious symptoms.Subsequently,this SBV106 fragment was cloned into pGEM-T vector,and after blue-white selection,positive plasmids were digested with EcoRⅠand a 106 bp fragment was obtained by agarose gel electrophoresis.The corresponding bacterial solution was sequenced and the result showed SBV106 has a 100%identity with SBV genome(GeneBank accession number:AF092924).These results together suggested SBV106,as a molecular marker for detecting Sacbrood,could be applied to apiculture.

SBV;molecular marker;PCR;clone

国家蜂产业技术体系建设专项资金（CARS-45-KXJ7）、福建农林大学科技发展资金（KF2015123）、福建省自然科学基金指导性科技计划项目（2012D079）资助

熊翠玲（1977-），硕士，实验师，从事蜜蜂病敌害研究

陈大福（1973-），博士，副教授，从事蜜蜂保护学研究；郭睿（1987-），博士，讲师，从事蜜蜂保护学研究