冬小麦黄矮病毒的分子生物学鉴定试验研究

杜秋丽

（济南大学泉城学院，山东 烟台 265600）

冬小麦黄矮病毒的分子生物学鉴定试验研究

杜秋丽

（济南大学泉城学院，山东 烟台 265600）

本研究以检测冬小麦黄矮病毒（BYDV-PAV）的分子生物学特征为目的。首先，通过电击法将3种质粒（UV1304、UV1306、UV1304rtd）转化土壤农杆菌（EHA105、4404，GV3101等）。然后，通过机械损伤使含有上述质粒的农杆菌侵染小麦（西农749、小偃6号、张氏3个品种），并将侵染后的小麦放在室外进行处理，至表现出感染病毒的症状时提取病毒RNA并进行检测。经过一段时间的处理后，只有西农749表现出症状，RNA电泳也显示出提取物中存在RNA，但是经过RT-PCR反转录然后再PCR扩增cDNA后进行电泳出现负结果。3种质粒的cDNA电泳结果出现相似现象：以CP5′＋MPR1为引物得到的cDNA电泳均无条带；其他引物得到的cDNA电泳均显示相似的条带，而且因引物不同条带位置也不同。

冬小麦黄矮病毒（BYDV-PAV）；土壤农杆菌（GV3101）；反转录PCR（RT-PCR）；聚合酶链式反应（PCR）

1 研究背景和意义

1.1 研究背景

大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Viruses)，在全世界均有分布，其寄主广泛，可侵染150多种单子叶植物，特别是大麦、小麦、燕麦、水稻等多种禾谷类作物。每年在全球范围内，此类病毒对粮食生产会造成一定程度的危害，大发生时会导致严重减产。这类病毒除了在经济上的重要性外，它们的基因表达机制、进化与传播介体和寄主的作用机制，几十年来一直吸引着人们的研究兴趣[1～4]。

1.2 研究意义

小麦黄矮病是我国北方麦区的主要病毒病，由大麦黄矮病毒 (Barley Yellow Dwarf Virus，简称BYDV)引起。该病的流行难以预测，发病后又不可治愈，被称为“小麦癌症”，一般年份减产5%～10%，流行年份减产30%以上，历史上因小麦黄矮病毒感染而导致巨大经济损失的实例普遍存在。本试验通过农杆菌介导法侵染冬小麦研究大麦黄矮病毒（BYDV-PAV）的分子生物学特性，并且研究BYDV-PAV在冬小麦中的表达情况，为培育抗病毒冬小麦提供条件。

2 试验材料与方法

2.1 材料与器材

2.1.1 材料

小麦黄矮病毒（PAV）毒源（国外友人提供）；反转录酶；TaqDNA聚合酶和连接酶；PCR反应的引物；LB培养基；大肠杆菌DH5α；小麦品种：小偃、西农749、张氏；土壤农杆菌（EHA105、4404，GV3101等）；3种质粒（UV1306、UV1304、UV1304rtd）由本实验室测序正确并保存；RT-PCR试剂盒；cDNA电泳所需要的琼脂胶。

2.1.2 器材

恒温培养箱、超净工作台、离心机、电转仪PCR仪、移液枪、微波炉、电泳仪、研钵和冰箱等。

2.1.3 LB培养基的配方

LB培养基的配方为蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L。待完全溶解后用5 mol/L的NaCl溶液调节pH值到7.0，加水定容至1 L，1.034 Pa高压蒸汽灭菌20 min。配制固体培养基时，每200 mLLB中加入3～4 g琼脂。

2.1.4 土壤农杆菌感受态细胞的制备

①将所选用的农杆菌菌株（EHA105、4404，GV3101等)从活化的平板上挑取单菌落，接种到加有3～5 mL LB培养基的试管中摇过夜培养。②按1%比例接种扩大培养。③5 000 rpm，5 min。收集菌体，用ddH2O洗6遍。④加入培养物体积0.003倍的10%甘油，分装。⑤电转化时取60 uL加小于2 uL的DNA质粒，进行电转。

2.1.5 RT-PCR体系

H2O：3.75 uL；10×Rtbuffer：1 uL；dNTPs：1 uL；Mg-Cl2：2uL；1﹟RNA反转录酶：0.5uL；2﹟RNAinhibitor：0.25uL；引物：0.5 uL；RNA：1 uL。

2.1.6 PCR体系

H2O：14uL；10×Buffer：2uL；Primer：1uL；Taq酶：1uL；dNTP：1 uL；模板：1 uL。

2.2 方法与步骤

2.2.1 质粒DNA的提取

①将含有2 mL含卡纳霉素的LB液体培养基加入到试管中，分别接入上述的含3种质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。②将培养物导入1.5 mL的离心管中，12 000 r/min离心30 s。③吸取培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。④浆细胞沉淀悬浮于200 μL溶液I中，用涡旋振荡器充分旋起沉淀，室温放置5 min。⑤加300 μL溶液I（I新鲜配制），盖紧管皿，轻轻滚动，上下颠倒，使溶液I与溶液II充分混匀，冰上放置5 min。⑥加入300 μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，轻轻颠倒数次，混匀，冰上放置10 min。⑦加入250 μL氯仿，轻轻颠倒数次，使盖上的蛋白质沉淀。⑧12 000 r/min离心10 min，转移上清（约600 μL）至新的离心管。⑨向上清中加入等体积的氯仿，反复混匀，12 000 r/min离心5 min，溶液分层，轻轻从离心机中取出。⑩小心吸取400 μL上清至新的离心管。向上清中加入2倍体积的无水乙醇，沉淀DNA后，进行混匀，室温放置5～10 min。12 000 r/min离心5 min，弃上清，用吸水纸吸干管口。1 mL70%乙醇洗质粒2次，轻轻弹起沉淀，离心，弃上清，空甩，风干5 min。

2.2.2 质粒转化土壤农杆菌感受态细胞

①取3个1 mL离心管，每管装入80 μL感受态细胞以及2 μL质粒。②将质粒和感受态细胞转移到电击杯中。将电击杯插入电转仪内，按下pulse键，几秒后电转仪指示灯发生变化时提出电击杯。③将900 μL培养基吸入电击杯内，移液枪打洗混匀。④将电击杯内液体吸净，转入原来的管内。

2.2.3 转化后菌体培养

①将转化完的菌液放入恒温箱中，28℃培养1 h。②配制培养基，倒平板（20 mL培养基中加入50 μL利福平和20 μL卡那霉素）。③涂平板，并将涂好的平板放入27℃培养48 h。④挑菌（每块板上挑取两个克隆）放入盛有3 mL培养液（每20 μL培养液含50 μL利福平和8～9 μL卡那霉素）的试管中。⑤摇菌：27℃震荡培养20～24 h。⑥再次扩大培养：取6支装有20 mL的三角瓶，并标名（每瓶加50μL利福平、20μL四环素、20μL卡那霉素）分别加入400～600 uL菌液。⑦对应每支试管取两支离心管。一支加入10%甘油150 μL加300 μL菌液，放入-80℃保菌；另一支加入菌液，4℃短期保菌。⑧试管中剩余的菌液，在三角瓶中扩大培养摇菌48h。⑨将菌液倒入大离心管中5 000 r/min，5 min弃去上清，加入10 mL小麦转化液悬浮。⑩用人工损伤小麦，接种农杆菌，对照组用小麦转化液处理，处理后将小麦放入室外。

2.2.4 RNA提取

①取黄花叶片4～5片，剪碎，立即液氮研磨成粉末状。②将粉末尽快转入细胞裂解液中并剧烈震荡至组织分散，室温下放置5 min。③加入0.2 mL氯仿充分震荡，室温下放置2～3 min。4℃，12 000 r/min，离心15 min。④冰浴上取上清液250 μL于离心管中，并加入250 μL异丙醇，静置10min，4℃，12000r/min，离心10min。⑤弃去上清，沉淀用DEPC水配制的70%～75%乙醇洗2次。⑥用30 uLDEPC灭菌水溶解，放在-80℃保存。

2.2.5 RNA电泳检测(琼脂糖凝胶电泳)

具体操作步骤略。

2.2.6 RT-PCR

用实验室已购买好的试剂盒加入模板进行反应。

2.2.7 cDNA进行PCR

CP5′＋MPR1为引物，应该得到500 bp；CP5′＋PAV3R为引物，应该得到603 bp；PAV3F＋dMPR1为引物，应该得到100 bp；ORF6＋PAV3R为引物，应该得到391 bp（阴性对照只加入水，阳性对照分别加入冰箱内保存的1304、1306、1304 rtd质粒）。

2.2.8 cDNA进行电泳检测（琼脂糖凝胶电泳）

3 结果与分析

3.1 试验结果

3.1.1 小麦出现的症状

西农749表现出病毒感染的症状，张氏和小偃6号这两个品种表现出被病毒侵染的症状。

3.1.2 RNA电泳结果

提取的RNA每一大管分为两小管，进行电泳，结果如表1所示。

表1 RNA电泳结果表

3.1.3 反转录后进行电泳的结果

①以dMP1和PAV3R为引物进行反转录PCR，反转录成的cDNA经过PCR扩增，并将扩增产物进行电泳，没有出现条带。②以CP5′和PAV3R为引物进行反转录PCR，反转录成的cDNA经过PCR扩增，并将扩增产物进行电泳，3种质粒均出现大小稍微大于500 bp的条带。③以dMP1和PAV3F为引物进行反转录PCR，反转录成的cDNA经过PCR扩增，并将扩增产物进行电泳，3种质粒均出现大小为200 bp左右的条带。④以dMP1和PAV3R为引物进行反转录PCR，反转录成的cDNA经过PCR扩增，并将扩增产物进行电泳，3种质粒均出现大小600 bp左右的条带。

3.2 结果分析

由于试验具有随机性，又重复做了几次，反转录后进行PCR扩增后再电泳但都是出现类似结果，不能确定病毒的存在，无法对其进行分子生物学鉴定，所以试验得到的是负结果。

推测出现这种结果导致试验没有得出正结果的原因可能有以下几种：第一，试验过程中某些操作没严格执行，影响了结果；第二，反转录步骤出现了问题，只是转录了其中的一部分片段而且这一个片段的大小大于500 bp；第三，提取出的RNA为小麦RNA，并没有BYDV-PAV病毒的RNA，用农杆菌介导侵染小麦后病毒基因并没有得到复制和表达，而表现的症状是其他病毒引起的；第四，试验进行时外界环境不合适。

[1]晋治波.黄矮病毒GAV基因组全序列分析及运动蛋白介导的抗病毒小麦的研究[D].中国农业科学院植物保护研究所,2003.

[2]广和.世界大麦黄矮病研究概况[J].世界农业,1989,(7):38 241.

[3]吴云峰,李毅,魏宁生,等.大麦黄矮病毒的循回传播机理[J].西北农业大学学报,1997,25(6).

[4]常胜军,王锡锋,马占鸿,等.大麦黄矮病毒GAV株系外壳蛋白基因的克隆和序列分析[J].病毒学报,1999,15(4):1 000.

1005-2690（2016）08-0113-02

：S512.11；S435.12

：B

2016-07-12）