抗结核药物性肝损伤大鼠肝组织TUG1、NEAT1、Gas5的表达观察

田慎谦，王悦，牛琛，李玉红，朱凌妍，任琦，郑国颖，冯福民

(华北理工大学公共卫生学院，河北省煤矿卫生与安全重点实验室, 河北唐山 063000)



抗结核药物性肝损伤大鼠肝组织TUG1、NEAT1、Gas5的表达观察

田慎谦，王悦，牛琛，李玉红，朱凌妍，任琦，郑国颖，冯福民

(华北理工大学公共卫生学院，河北省煤矿卫生与安全重点实验室, 河北唐山 063000)

目的 观察抗结核药物性肝损伤(ADLI)大鼠肝组织长链非编码RNA(lncRNA)TUG1、NEAT1、Gas5的表达变化。方法 56只SPF级SD大鼠随机分为A、B、C、D、E、F组和对照组各8只，A、B、C、D、E、F组大鼠予异烟肼55 mg/kg灌胃，1 次/d,分别于给药3、7、10、14、21、28 d时处死，对照组大鼠予等容积蒸馏水灌胃，于灌胃28 d处死。采用荧光定量PCR法检测各组肝组织TUG1、NEAT1和Gas5，并检测TUG1上游分子SP1及下游分子HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 mRNA。结果 各实验组和对照组中NEAT1、Gas5比较，P均>0.05。A、B、C、D、F组TUG1相对表达量与对照组比较，P均<0.05。B、C组SP1 mRNA的相对表达量与对照组比较，P均<0.05;A、C、D组HOXB7 mRNA相对表达量与对照组比较，P均<0.05；E、F组KLF2 mRNA相对表达量与对照组比较，P均<0.05；C、D、E、F组Bcl-2 mRNA的相对表达量与对照组比较，P均<0.05；B、C、E组Caspase-3 mRNA的相对表达量与对照组比较，P均<0.05。结论 ADLI大鼠肝组织TUG1低表达，其可能通过调控HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达参与ADLI的发生、发展。

抗结核药物性肝损伤；长链非编码RNA；TUG1；NEAT1；Gas5

异烟肼是目前常用的一线抗结核药物，但使用不当其易导致抗结核药物性肝损伤(ADLI)[1]，最终导致结核化疗方案改变、中断,患者出现肝衰竭等不良反应，严重影响结核的治疗及患者预后。目前ADLI的具体发病机制尚不明确[2]。长链非编码RNA(lncRNA)在基因印记、细胞周期调控、转录的抑制和激活等各种生物生理活动起重要作用[3]。研究[4]发现lncRNA中的 TUG1、NEAT1、Gas5在人、大鼠、小鼠肝组织中均可表达，且在肝癌的细胞增殖、细胞凋亡、侵袭、迁移中起重要作用。病毒性肝炎、药物性肝损伤等肝脏疾病中往往也伴随着异常的细胞凋亡和增殖，但TUG1、NEAT1、Gas5 与ADLI的关系尚不明确。2014年9月～2016年3月，我们观察异烟肼导致的ADLI大鼠肝脏组织中TUG1、NEAT1和Gas5变化。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器 56只SPF级SD大鼠[北京华阜康生物科技公司，动物许可证号：SCXK(京)2009-0004]，8～9周龄，体质量258～365 g，雌雄各半。异烟肼(沈阳红旗制药有限公司，批号：1404022)，TRIpure Reagent(北京百泰克生物技术有限公司，批号：0020141224)，PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒(大连TaKaRa公司)，SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(大连TaKaRa公司)，MDA、SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)。HITACHI 7600-020全自动生化分析仪(日本日立公司)；Heraeus高速冷冻离心机(德国Thermo Scientific公司)；C1000PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司)；荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。

1.2 大鼠分组及ADLI模型制备方法 56只大鼠随机分为A、B、C、D、E、F组和对照组各8只，A、B、C、D、E、F组每天异烟肼55 mg/kg灌胃，1次/d，对照组予等容积蒸馏水灌胃，制作ADLI模型。A、B、C、D、E、F组分别于给药第3、7、10、14、21、28天时处死大鼠，对照组于第28 天处死大鼠，取肝组织50～100 mg备用。

1.3 各组大鼠肝组织TUG1、NEAT1、Gas5检测 采用荧光定量PCR法。取大鼠肝组织，常规TRIzol法提取总RNA，反转录和实时荧光定量PCR严格按照试剂盒说明书进行操作。以GAPDH为内参，用 2-ΔΔCt来表示各RNA的相对表达量。引物均由上海生工合成，其序列如下：TUG1上游引物5′-TACGTCCCGTGCCTCCTGAT-3′，下游引物5′-AGGGCTGTGCTGAATCTGGG-3′； NEAT1上游引物5′-ACTGCTTGACACCCCATGCC-3′，下游引物5′-CGGTGATGACCACGGCTACC-3′；Gas5上游引物5′-AGCCAGAAAATGGGATGGTGGA-3′，下游引物5′-TGTGGAGCTTGCCATGCCTT-3′； GAPDH上游引物5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，下游引物5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。反转录反应条件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃1 min；定量PCR反应条件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40个循环。

1.4 TUG1上游分子SP1及下游分子HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 的mRNA检测 采用荧光定量PCR法检测方法“1.3”中存在统计学差异的TUG1的上游分子SP1及其下游分子HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3、p15、p16、p27和p57 mRNA表达，所有操作均同“1.3”。引物序列如下。SP1上游引物5′-TGCAGCAGAATTGAGTCACC-3′，下游引物5′-CACAACATACTGCCCACCAG-3′；HOXB7上游引物5′-CACTACAATCGCTACCTGACTCG-3′，下游引物5′-TTCCTCCTCTTCCTCCTCGT-3′；KLF2上游引物5′-TCGCACCTAAAGGCGCATC-3′，下游引物5′-TAGTGGCGGGTAAGCTCGTC-3′；Bcl-2上游引物5′-GGGATGCCTTTGTGGAACTAT-3′，下游引物5′-AGGTATGCACCCAGAGTGATG-3′；Caspase-3上游引物5′-GGTATTGAGACAGACAGTGG-3′，下游引物5′-CATGGGATCTGTTTCTTTGC-3′。反转录反应条件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃1 min；定量PCR反应条件：95 ℃30 s ，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40个循环。用 2-ΔΔCt来表示各mRNA相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料表示，组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织TUG1、NEAT1及Gas5表达比较 各组大鼠肝组织TUG1、NEAT1及Gas5表达比较见表1。

表1 各组大鼠肝组织TUG1、NEAT1和Gas5表达比较

2.2 各组大鼠肝组织SP1、HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相对表达量 各组SP1、HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相对表达量比较见表2。

表2 各组大鼠肝组织SP1、HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相对表达量比较

3 讨论

异烟肼毒性代谢产物主要通过与肝细胞大分子物质共价结合[5]引起肝细胞坏死和脂肪变性导致ADLI，除此之外过氧化应激反应、人体乙酰化速率、以及药物代谢酶等均与ADLI有关。最新研究发现表观遗传学在ADLI的发生、发展中起重要作用。

NEAT1、Gas5 和TUG1均具有重要的调控功能。Gas5可通过负调控microRNA-21的表达，促进肝癌细胞的侵袭和转移[4]，还可通过调控波形蛋白的表达促进细胞增殖[5]。NEAT1表达改变影响肝癌的发生和转移，其高表达与MDTH、NM23和MALAT1有关[6]。TUG1能够影响细胞增殖和凋亡，在很多疾病中都发挥着重要的调控功能，如肝癌[7]、胃癌[8]、肺癌[9]、骨肉瘤[10]、动脉粥样硬化[11]以及低温导致的肝细胞损伤[12]等。本研究中NEAT1、Gas5在对照组和各实验组大鼠肝组织中的表达差异无统计学意义，说明二者在异烟肼所致的ADLI中作用较弱。而TUG1在ADLI大鼠中表达呈下降趋势，表明TUG1在ADLI的发生和发展中起重要作用。为进一步探讨TUG1在ADLI发生、发展中的作用机制，本研究对TUG1的上游分子SP1和下游分子HOXB7、KLF2、Caspase-3、Bcl-2 mRNA进行了检测和分析。转录因子SP1是TUG1的上游分子，它可以通过TUG1启动子区域的5个结合位点直接与TUG1结合，进而调控TUG1的转录[7]。本研究结果显示，与对照组相比，实验组SP1 mRNA与TUG1表达水平均呈下降趋势，在下降至最低点后都略有回升，二者变化趋势一致且SP1属于TUG1上游分子，说明在异烟肼引发肝损伤过程中，SP1可能调控了TUG1的表达，其表达量降低进一步导致了TUG1表达下降。

许多lncRNA能够将蛋白家族以多梳抑制复合物2(PRC2)招募到特定的基因位点[13]，使该基因启动子区发生改变，进而抑制其表达。TUG1也是其中一员，它可以通过与PRC2结合来调控其下游分子p15、p16、p27、p57、HOXB7和KLF2基因的表达，从而影响细胞的增殖和凋亡[7,9,14,15]。

HOXB7参与调控多种信号通路，在癌细胞的增殖、分化、侵袭、迁移、黏附等活动中都扮演着重要的角色[16]。本研究中，随ADLI时间延长，HOXB7 mRNA的相对表达量先升高后降低，而TUG1的相对表达量在给药第10天降至最低，给药第14天有所回升。虽然HOXB7 mRNA变化趋势与lncRNA TUG1相反，但HOXB7 mRNA发生变化的转折点早于TUG1，这说明HOXB7可能只是部分受TUG1的调控。

KLF2为锌指Kruppel样转录因子家族中的一员,肝癌细胞中过表达KLF2可导致G0/G1期阻滞[8]，诱导细胞凋亡[17]。此外，KLF2还可调控c-Myc基因的表达[18]，c-Myc广泛参与细胞的增殖、凋亡、细胞周期等进程[19]。由此可见，KLF2在细胞的增殖和凋亡过程中同样发挥着重要的作用。KLF2 mRNA的表达总体呈上升趋势，给药第21天升高，与TUG1总体变化趋势相反，但其改变滞后于TUG1，提示TUG1可能通过抑制KLF2的表达调控ADLI的发生、发展。研究[15]发现，在小鼠胰岛瘤细胞中干扰TUG1表达，细胞凋亡蛋白Caspase-3表达升高，而抗凋亡因子Bcl-2表达降低，细胞凋亡率升高。本研究结果显示，各实验组大鼠肝细胞Bcl-2表达下降，与TUG1变化一致，而Caspase-3表达逐渐升高，表明TUG1与肝细胞凋亡有关。但TUG1究竟如何影响Caspase-3和Bcl-2基因的表达还有待进一步研究。

综上所述，ADLI大鼠肝组织TUG1低表达，其可能通过调控HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达参与ADLI的发生、发展，但其具体作用机制尚有待于进一步研究。

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唐山市重点实验室基金资助项目(08150201A-1-8)。

冯福民(E-mail: fm_feng@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.009

R575

A

1002-266X(2016)39-0030-03

2016-05-25)