提取油茶籽抗氧化活性物质的研究

◎ 曾丽珠，李 轩，张 昊

（阳江出入境检验检疫局，广东 阳江 529500）

提取油茶籽抗氧化活性物质的研究

◎ 曾丽珠，李 轩，张 昊

（阳江出入境检验检疫局，广东 阳江 529500）

本文选用石油醚（弱极性）、乙酸乙酯（中等极性）、正丁醇（强极性）三种不同萃取剂分离提取油茶籽中的抗氧化物，测定和比较不同萃取层的总酚含量、清除DPPH自由基活性和还原能力发现，活性较强部分主要分布在中等极性的乙酸乙酯层。取抗氧化活性最强的乙酸乙酯层萃取物用乙酸乙酯∶甲醇梯度洗脱剂过柱，发现抗氧化活性部分主要富集于9∶1段和6∶4段。相比于市售茶油，亚临界茶油含有更多的有效抗氧化成分并具有更好的抗氧化效果。

提取；油茶籽；抗氧化活性

1 研究背景

1.1 油茶籽的应用价值

油茶（Camellia oleifera Abe1）隶属于山茶科（Theacese）山茶属（Camellia L），是我国特有的食用油料树种，脂肪酸组成与在西方被誉为“液体黄金”的橄榄油相似，长期食用茶油，具有预防心脑血管疾病、抗肝炎、抗衰老、防癌抗癌等功效。而油茶籽油具有多种功效，归功于其含有多种功能性成分，如角鲨烯、茶多酚、山茶皂甙、山茶甙等活性物质[1]。

目前，国内外使用较多的是合成抗氧化剂，如没食子酸丙酯（PG）、二叔丁基羟基甲苯（BHT）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）或丁基羟基茴香醚（BTA）等[2]，但随着人们食品安全意识的提高，对合成添加剂的添加提出了质疑。从油茶籽中提取出高效安全低毒的抗氧化活性物质，成为进一步开发天然高效食品抗氧化剂的重要途径。

1.2 亚临界萃取技术的应用

传统的油茶籽油的提取工艺主要有压榨法、有机溶剂浸提法、水蒸气蒸馏法、油脂分离法等，新型的提取工艺则有超临界萃取法[3]和亚临界萃取，显然前几种的提取方法都会一定程度上影响茶油的成率和品质，超临界CO2提取茶籽油尽管产品质量好、得率高，但设备要求高，一次性资金投入较大。而亚临界萃取作为其中一种新型提取工艺，有着条件相对温和，对高压设备要求不苛刻和成本更低的优点。

1.3 研究的目的与意义

本文通过提取油茶籽中不同极性物质，对不同极性的萃取物质进行总酚含量的测定，并利用油茶籽油中不同极性萃取物进行自由基清除能力试验，初步探明不同极性酚类物质的抗氧化能力和清除自由基的效果，有利于有针对性地分离、提取活性物质。在发现油茶籽中含有中等极性的抗氧化活性成分的基础上，进一步研究亚临界茶油的抗氧化活性，从而为论证亚临界茶油的高品质奠定基础。

2 材料与方法

2.1 材料与设备

油茶籽；油茶籽醇提物：自制（油茶籽经挑选后热风干燥，用70%乙醇，在35 ℃下提取30 min，料液比1∶30，减压浓缩真空干燥，密闭、低温保存备用）；市售茶油、亚临界茶油，参数选择：原料堆密度0.7 kg/L，萃取时间70 min，萃取压力0.5 MPa，萃取温度45 ℃，颗粒度10目，亚临界丁烷；没食子酸（GA）标准品；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼；三氯乙酸。

鼓风干燥箱，旋转蒸发仪，真空泵，超声清洗器，、数显恒温水浴箱，棱光紫外分光光度计，中药粉碎机。

2.2 实验方法

（1）油茶籽醇提物的分级萃取。称取一定量的油茶籽醇提物，用水配制成悬浮液，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次。各不同极性的萃取液合并后用旋转蒸发仪减压浓缩至干粉，即得到分级萃取各相，分别为石油醚相、乙酸乙酯相，正丁醇相及水分级相。

（2）油茶籽醇提物及其各分级萃取相的总酚含量测定。标准曲线的制定：准确称取真空干燥至恒重的没食子酸标准品44.3 mg，用水溶解并定容至100 mL。以此溶液配成浓度为8.86、17.72、35.44、70.88 μg/mL和88.60 μg/mL的溶液。分别取上述不同溶液1 mL加到10 mL比色管中，依次加入1 mL去离子水，0.5 mL已稀释2倍的福林-酚试液，1.5 mL 26.7%Na2CO3溶液，最后用水定容至10 mL，室温下反应2 h，在760 nm下测定其吸光度。由吸光度对浓度进行回归分析，绘制标准曲线。试样的测定：准确称取适量试样，用水溶解，浓度在0.08 mg/mL左右。取1 mL样品液加到10 mL比色管中，测得的吸光度代入标准曲线，求得试样中总多酚的含量。

（3）清除DPPH自由基活性的测定。试样的测定：分别将各相萃取物提取液4 mL和2×10-4mo1/L DPPH溶液1 mL加入同一具塞试管中摇匀，在室温下密闭静置30 min，用纯溶剂甲醇作参比液，于517 nm波长下测定吸光度。根据公式（1）计算每种提取液对DPPH自由基的清除率。

其中，As为加4 mL提取液后DPPH溶液的吸光度；Asb为4 mL提取液+1 mL溶剂（甲醇）后的吸光度；Ac为4 mL溶剂（甲醇）+1 mLDPPH溶液的吸光度。

（4）还原能力的测定。在2.5 mL pH=6.6的磷酸盐缓冲液中加入不同浓度的试样液2.5 mL，1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，混合物在50 ℃恒温20 min后，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3 000 r/min离心分离10 min，取上层清液5 mL加蒸馏水5 mL和0.1% FeC13溶液1 mL，在700nm处测定吸光度，即为OD值。吸光度越高，还原能力越强。

3 结果与分析

3.1 油茶籽醇提物不同萃取层中总酚含量

以标准没食子酸浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归分析得标准回归方程为y=0.007 9x+0.045 6，线性相关系数R2=0.9961。利用没食子酸浓度与吸光值的关系标准曲线图，可根据吸光值推测定试样的没食子酸浓度。在碱性溶液中，颜色的深浅与多酚含量呈正相关，蓝色化合物在760 nm处有最大吸收。一般用没食子酸（或焦性没食子酸）作为参照标准。提取物中总多酚的含量以等同于没食子酸的量表示。

取各不同极性的干粉，配置成相同浓度，利用没食子酸标准曲线测定其中总酚含量，总酚含量大小依次为：正丁醇＞乙酸乙酯＞水层＞石油醚层。

3.2 油茶籽醇提取物不同萃取层清除DPPH自由基活性

相同浓度下，不同萃取层清除DPPH自由基活性的能力不同，自由基清除能力大小依次为：乙酸乙酯＞正丁醇＞水层＞石油醚层。在所测浓度内，乙酸乙酯层表现出较强的自由基清除能力。

3.3 油茶籽醇提取物不同萃取层还原能力

各萃取层样品反应后的生成物在700 nm下的吸光度大小，可反映出物质抗氧化能力的强弱。OD值由大到小依次为：乙酸乙酯＞正丁醇＞水层＞石油醚层。结合以上三点可知，油茶籽醇提取物中不同萃取层的还原能力、DPPH清除率与酚类含量呈正相关关系。

3.4 乙酸乙酯层柱层析后抗氧化活性比较

取乙酸乙酯层萃取物，过100～200目硅胶柱，以乙酸乙酯∶甲醇进行梯度洗脱，洗脱比例分别为：10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4和5∶5（极性依次增加）。每个梯度洗脱3倍柱体积，分段收集，以自由基清除率和还原能力为评价指标进行检测。以自由基的清除率为比较指标得出：6∶4＞9∶1＞油茶籽醇提取物＞10∶0＞7∶3＞8∶2＞5∶5。以还原能力为比较指标：9∶1＞油茶籽醇提取物＞6∶4＞10∶0＞7∶3＞5∶5＞8∶2。结果进一步论证了油茶籽中抗氧化成分的存在及其极性大小。

3.5 亚临界茶油与市售茶油的自由基清除能力比较

市售茶油和亚临界茶油均有清除DPPH自由基的能力，且清除能力与样品的浓度呈现正相关关系，随着样品浓度的增大其清除能力也越大。但随着浓度的增加，亚临界茶油的自由基清除能力明显高于市售茶油，这可能与其含有较多的有效抗氧化成分有关。

4 结语

油茶籽中含有抗氧化活性成分。利用活性跟踪方法发现，对油茶籽醇提取物进行分级萃取，其活性较强的部分集中在乙酸乙酯层，过柱后活性部位主要富集在9∶1和6∶4，且初步研究得出亚临界茶油的自由基清除率优于市售精炼茶油。

[1]毛方华，王鸿飞，刘 飞等.茶籽油的提取及其对自由基清除作用的研究[J].西北林学院学报，2009（5）：125-128.

[2]董新荣，刘宇光，李本祥.芝麻酚对茶油抗氧化活性研究[J].食品研究与开发，2008（7）：19-21.

[3]李川山，陈 晔.植物精油提取工艺研究进展[J].大众科技，2010（9）：86-87.

The Research about the Antioxidant Activity of Tea Seed

Zeng Lizhu, Li Xuan, Zhang Hao
(Yangjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Yangjiang 529500, China)

The antioxidant activities of tea seed were separated and extracted by three different kinds of extracting agent—petroleum ether (low-polar), ethyl acetate (middle-polar) and lsobutanol (strong-polarity), the stronger active part was mainly distributed in the ethyl acetate layer of middle-polar through measuring and comparing the content of total polyphenol, DPPH radical scavenging rate and reductive ability from different extraction layer. The strongest antioxidant activity extraction from ethyl acetate layer was elutinged by the gradient elution liquid of ethyl acetate：methanol, the activity part was mainly occurred in 9：1and 6：4. Compared to the tea seed oil on sale, sub-critical tea seed oil had more effective antioxidant content and better antioxidant eff ect.

Extract; Tea seed; Antioxidant activity

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.20.038

TS229