腺样体肥大患儿鼻咽部分泌物中胃蛋白酶的检测*

张春林，李柳金，李春雷，林季珍，邓泽义，王科，刘兆辉

（1.遵义医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科，贵州 遵义 563003；2.南方医科大学珠江医院耳鼻咽喉头颈外科，广东 广州 510282）

临床论著

腺样体肥大患儿鼻咽部分泌物中胃蛋白酶的检测*

张春林1，李柳金1，李春雷1，林季珍1，邓泽义2，王科1，刘兆辉1

（1.遵义医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科，贵州 遵义 563003；2.南方医科大学珠江医院耳鼻咽喉头颈外科，广东 广州 510282）

目的检测腺样体肥大（AH）患儿鼻咽部分泌物中胃蛋白酶的表达，并探讨其与AH的关系。方法选取AH患儿作为实验组，收集无腺样体和扁桃体肥大的患儿作为对照组，采用酶联免疫吸附试验检测鼻咽部分泌物和腺样体组织中胃蛋白酶的表达，并进行比较。分别根据AH合并或不合并扁桃体肥大和腺样体的肥大程度对实验组进行分组，比较亚组间胃蛋白酶的表达。结果实验组和对照组中胃蛋白酶浓度和阳性率分别为（2.801±1.544）和（1.074±0.387）ng/ml，55.8%（24/43）和0.0%（0/22），差异有统计学意义（P=0.000）。实验组亚组分析，AH不伴扁桃体肥大（A组）和AH伴有扁桃体肥大（B组）的胃蛋白酶浓度和胃蛋白酶阳性率分别为（2.907±1.694）和（2.699±1.420）ng/ml，57.1%（12/21）和54.5%（12/22），差异无统计学意义（P=0.568和0.864）；腺样体Ⅱ度大亚组（堵塞后鼻孔＞75%）中胃蛋白酶浓度和阳性率均高于腺样体Ⅰ度大亚组（堵塞后鼻孔50%～75%），差异有统计学意义（P=0.000和0.046）。结论部分AH患儿的鼻咽部分泌物中检测到胃蛋白酶，胃内容物的鼻咽部反流可能与AH有一定的关系。

腺样体肥大；胃内容物反流；鼻咽反流；胃蛋白酶；

腺样体肥大（adenoid hypertrophy，AH）是小儿的常见病、多发病，既往认为邻近器官病变刺激、病原微生物感染及变态反应等都是可能的病因[1]。近些年，胃内容物的食管外反流在上呼吸道、消化道病变中的致病作用有逐渐被认识，其中引起损伤的主要是胃酸和胃蛋白酶[2]。有研究提示，小儿鼻窦炎、分泌性中耳炎与胃内容物反流进入鼻腔、中耳腔有关[2-5]。由于胃内容物反流到鼻腔、中耳腔，必须经过腺样体表面，刺激淋巴组织免疫应答而导致增生，所以腺样体肥大与胃内容物反流的相关性也逐渐被认识[6]。由于胃蛋白酶仅存在于胃内，在其他部位检测到胃蛋白酶可以作为胃内容物反流的一种方法，本课题通过检测鼻咽部分泌物和腺样体组织内胃蛋白酶的表达，探讨胃内容物鼻咽部反流与腺样体肥大的关系。

1 资料与方法

1.1 病例资料

选取2013年5月-2014年10因鼻塞、张口呼吸、打鼾等症状就诊于本院，经鼻咽镜检查确诊为腺样体肥大的患儿（腺样体堵塞后鼻孔＞50%）作为实验组。选取因耳前瘘管、耳鼻喉科外伤等需行全身麻醉手术的患儿，并排除合并腺样体和扁桃体肥大，无喉咽反流及胃食管反流症状作为对照组。排除标准：①近3个月内曾使用质子泵抑制剂等抑酸药物；②患有免疫系统疾病或有其他严重系统疾病；③2周内曾发生过上呼吸道感染。本实验的设计、实施通过遵义医学院附属医院伦理委员会通过，所有实验标本的获得及使用经患者家属书面同意。本研究中实验组患者43例，男性23例，女性20例；年龄2.5～10.0岁，平均5.4岁；病程3～52个月，平均16.3个月。对照组22例，男性14例，女性8例。年龄2.8～12.0岁，平均6.2岁。两组患儿在性别、年龄方面比较，差异无统计学意义（P=0.316和0.627）。

1.2 胃蛋白酶的检测

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosor bent assay，ELISA）可以定量检测唾液、中耳分泌物等胃液外体液中的胃蛋白酶浓度[7-9]，本研究使用ELISA进行鼻咽部分泌和腺样体组织中胃蛋白酶浓度的定量测定。所有标本的收集于全身麻醉生效后进行，鼻内镜下用5 ml注射器连接鼻腔吸管收集鼻咽部分泌物2 ml，置于-80℃冻存备用。对腺样体肥大需行腺样体切除术的患儿，术中在鼻内镜直视下切除腺样体，在保证病理检查所需组织量后，留取约1 cm2组织置于-80℃冰箱冷冻备用。检测鼻咽部分泌物标本时，若分泌物黏稠，则先以0.1%二硫苏糖醇（dithiothreitol，DDT）4倍体积充分混匀，37℃水浴10 min。对于腺样体组织，用生理盐水反复冲洗掉分泌物及血迹，用眼科剪剪碎组织，匀浆，全程冰上操作。所有标本均4℃、5 000 r/min离心15 min，取上清液，加入到人胃蛋白酶ELISA试剂盒（北京永辉生物技术有限公司），用全自动酶标仪（美国Thermo公司）检测。绘制标准曲线并进行分析，结果显示，标准品浓度与标准曲线测得浓度呈现较好的一致性，R2=0.98。由于正常儿童也可能存在生理性的胃内容物反流，本研究先用对照组标本进行测定胃蛋白酶浓度调零，获得标本的最终胃蛋白酶浓度，根据工作曲线及参考已发表文献[9]，检测阳性的分界值设为2.5 ng/ml，即浓度＞2.5 ng/ml说明在标本中胃蛋白酶为阳性，提示可能存在病理性反流。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，满足正态分布和方差齐性的用t检验，不满足者则用Wilcoxon检验。计数资料以率表示，组间比较用Pearson’s χ2检验或者Fisher’s精确概率法（n＜40或T＜1），检验水准为α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃蛋白酶的表达

实验组和对照组鼻咽分泌物中胃蛋白酶浓度和胃蛋白酶阳性率比较，差异有统计学意义（P=0.000）。实验组胃蛋白酶浓度和阳性率均高于对照组。实验组有3例腺样体组织中检测到胃蛋白酶，该3例患者的鼻咽分泌物中胃蛋白酶浓度与实验组的浓度比较，差异有统计学意义（P=0.030），腺样体组织中检测到胃蛋白酶的患者浓度更高。见表1和图1。

表1 两组患儿鼻咽部分泌物中胃蛋白酶表达量的比较

图1 各组患者胃蛋白酶的表达水平

2.2腺样体肥大胃蛋白酶表达的亚组分析

以扁桃体超出腭舌弓与悬雍垂连线的中线位置作为扁桃体肥大的标准，将实验组进一步分为两个亚组，即：腺样体肥大不伴扁桃体肥大（A组，21例）；腺样体肥大伴有扁桃体肥大（B组，22例）。A组和B组胃蛋白酶平均浓度分别为（2.907±1.694）和（2.699± 1.420）ng/ml，胃蛋白酶阳性率分别为57.1%（12/21），54.5%（12/22），亚组间比较，差异无统计学意义（P= 0.568和0.864）。本研究进一步进行鼻咽部胃蛋白酶表达水平与腺样体肥大程度的亚组分析，根据腺样体堵塞后鼻孔的程度，腺样体肥大分为2度：Ⅰ度肥大堵塞后鼻孔50%～75%，35例；Ⅱ度肥大堵塞后鼻孔＞75%，8例。腺样体Ⅱ度大亚组中胃蛋白酶浓度和胃蛋白酶阳性率均高于腺样体Ⅰ度大亚组，差异有统计学意义（P=0.000和0.046）。见表2和图1、2。

表2 两组患儿鼻咽部分泌物中胃蛋白酶阳性率的比较

图2 腺样体堵塞后鼻孔不同程度患者的胃蛋白酶表达水平（±s）

3 讨论

胃蛋白酶是由胃主细胞分泌的胃蛋白酶原在胃酸的作用下活化而来。正常生理状态下，胃蛋白酶仅存在于胃液内，而病理状态下可以进入上呼吸道和消化道，从而引起局部病变。有研究报道，在上呼吸道、消化道检测到胃内容物成分，如唾液、泪眼、中耳分泌物、鼻腔分泌物[3，7-9]，说明胃内容物反流可能是引起耳鼻喉科多种疾病的可能病因。现在多数研究采用24 h pH酸度计检测上呼吸道、消化道反流，但是24 h pH酸度计为有创检查，多数患儿家属难以接受。此外，由于胃内容物反流包括酸性反流，胆汁（碱性）反流及中性反流，24 h pH酸度计对碱性反流或中性反流诊断意义较小。由于胃蛋白酶仅存在于胃内，在其他部位检测到胃蛋白酶可以作为胃内容物反流的一种方法，SAMUELS等[10]对文献综合回顾分析，认为检测胃蛋白酶是诊断胃内容物反流的敏感性高、无创、快速、方便的客观诊断方法，KNIGHT等[11]发现，胃蛋白酶的诊断敏感性为100%，特异性为89%，可以应用于监测咽喉部反流事件。本研究通过检测鼻咽部分泌物中胃蛋白酶来诊断胃内容物的反流，发现腺样体肥大患儿的鼻咽部胃蛋白酶阳性率为55.8%，与KELES等[12]报道的通过24 h pH酸度计检测的结果基本一致，证实检测鼻咽部分泌物中的胃蛋白酶表达是检测鼻咽反流事件简便、快捷的客观检查方法。

此外，本研究还发现胃蛋白酶的表达与腺样体的肥大程度相关，说明胃内容物的鼻咽部反流可能与腺样体肥大的发病相关。腺样体肥大往往可以导致小儿鼾症，而上呼吸道阻塞造成的呼吸努力产生过大的胸腔内压，加重胃内容物反流，而过度的胃内容物反流又可以进一步刺激腺样体增生，从而造成一个恶性循环[13]。本研究还发现，腺样体肥大合并扁桃体肥大患儿的胃蛋白酶表达低于腺样体肥大不合并扁桃体的患者，虽然由于纳入病例数的限制，结果差异无统计学意义，笔者推测可能是扁桃体肥大患者造成口咽部的阻塞，阻碍胃内容物进入到鼻咽部，具体原因仍需进一步研究明确。本研究还在3例腺样体组织中检测到胃蛋白酶的表达，提示胃蛋白酶可通过主动或被动转运的方式进入到腺样体组织中，进而激发一系列的炎症反应，从而造成淋巴细胞增生。腺样体上皮为假复层纤毛柱状上皮，包括M细胞、树突状细胞等，构成腺样体的上皮屏障。滞留在腺样体隐窝内的胃内容物反流物可以损伤腺样体上皮，从而形成持续炎症。JOHNSTON等[14]通过细胞实验发现，喉黏膜上皮细胞的囊泡中有共存的胃蛋白酶与转铁蛋白，证实胃蛋白酶可以通过受体介导的胞饮而进入喉黏膜上皮，阐明胃蛋白酶介导的喉黏膜损伤的机制，但是腺样体黏膜上皮是否也存在类似的机制仍需后续的研究进一步研究。也有研究在部分腺样体肥大患儿的腺样体组织中检测到幽门螺杆菌[4]，所以胃蛋白酶是否与胃内容物中其他成分有协同致病效应尚不明确，仍需更进一步研究。

本课题通过检测鼻咽部分泌物中胃蛋白酶，发现部分腺样体肥大患儿中存在胃内容物反流到鼻咽部，胃蛋白酶浓度与腺样体的肥大程度有一定的关系，笔者推测，胃内容物的鼻咽部反流可能与腺样体肥大有关，具体机制仍需进一步研究。

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（童颖丹 编辑）

Detection of pepsin in nasopharyngeal secretions in children with adenoid hypertrophy*

Chun-lin Zhang1,Liu-jin Li1,Chun-lei Li1,Ji-zhen Lin1, Ze-yi Deng2,Ke Wang1,Zhao-hui Liu1
(1.Department of Otorhinolaryngology,Head and Neck Surgery,the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi,Guizhou 563003,China;2.Department of Otorhinolaryngology,Head and Neck Surgery,Zhujiang Hospital of South Medical University,Guangzhou,Guangdong 510282,China)

Objective To detect pepsin in the nasopharyngeal secretions in children with adenoid hypertrophy(AH),and then to explore its association with AH.Methods The pediatric AH patients and the pediatric patients without AH or tonsil hypertrophy(TH)were collected as experiment group and control group,respectively.The pepsin level in the nasopharyngeal secretions and adenoid tissues was detected using an enzyme linked immunosorbent assay kit,and then compared between the experiment group and the control group. Moreover,the experimental group was divided into subgroups according to the combination with TH(subgroup B)or not(subgroup A)and the degree of adenoid hypertrophy,respectively.The pepsin level was compared between the subgroups.Results The expression level and the positive rate of pepsin in the nasopharyngeal secretions in the experiment group and the control group were(2.801±1.544)and(1.074±0.387)ng/ml,and 55.8%(24/43)and 0.0%(0/22),respectively,the differences were statistically significant(P=0.000).In the experiment group,the pepsin level and positive rate in the subgroup A and the subgroup B were(2.907±1.694)and(2.699±1.420)ng/ml,and 57.1%(12/21)and 54.6%(12/22)respectively,there were no significant differences(P=0.568 and 0.864).Compared with the subgroup of degree I adenoid hypertrophy(50%-75% posterior nose blockage),significantly higher concentration and positive rate of pepsin were found in the subgroup of degreeⅡadenoid hypertrophy(＞75%posterior nose blockage,P=0.1913 and 0.3211). Conclusions Pepsin in the nasopharyngeal secretions is found in a relatively high proportion of AH patients, and there is most likely an association between the nasopharyngeal reflux of gastric contents and AH.

adenoid hypertrophy;gastric contents;nasopharyngeal reflux;pepsin

R765

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.014

1005-8982（2016）23-0068-04