聚焦超声对SD外阴慢性单纯性苔藓模型大鼠外阴皮肤P物质及P物质受体表达的影响

杨 欢，唐华均，李成志

(重庆医科大学生物医学工程学院 省部共建国家重点实验室培育基地—重庆市超声医学工程重点实验室重庆市生物医学工程学重点实验室 重庆市微无创医学协同创新中心，重庆 400016)

基础与实验研究

聚焦超声对SD外阴慢性单纯性苔藓模型大鼠外阴皮肤P物质及P物质受体表达的影响

杨 欢，唐华均，李成志*

(重庆医科大学生物医学工程学院 省部共建国家重点实验室培育基地—重庆市超声医学工程重点实验室重庆市生物医学工程学重点实验室 重庆市微无创医学协同创新中心，重庆 400016)

目的 探讨聚焦超声对SD外阴慢性单纯性苔藓模型大鼠外阴皮肤中P物质(SP)和P物质受体(NK1-R)表达的影响。方法 参考Sally法建造40只雌性SD大鼠外阴慢性单纯性苔藓模型，并随机分为治疗组(n=20)和对照组 (n=20)。治疗组予以聚焦超声治疗，对照组采用与治疗组相同的方法治疗，但仪器无功率输出。聚焦超声治疗2周后，取大鼠外阴皮肤，HE染色观察组织学改变，甲苯胺蓝染色观察肥大细胞总数及脱颗粒率，免疫组织化学方法检测SP和NK1-R的表达，比较两组指标差异。结果 聚焦超声治疗2周后，治疗组75.00%(15/20)大鼠外阴皮肤转为正常，对照组10.00%(2/20)大鼠外阴皮肤转为正常，差异有统计学意义(χ2=17.289，P<0.05)。治疗组肥大细胞总数及脱颗粒率及外阴皮肤中SP和NK1-R表达水平均明显低于对照组(P均<0.05)。结论 聚焦超声可抑制外阴慢性单纯性苔藓大鼠皮肤中SP的释放及NK1-R的表达，并降低肥大细胞总数，减少肥大细胞脱颗粒，减轻局部炎症反应。

超声疗法；外阴慢性单纯性苔藓；P物质；受体，神经激肽1

外阴慢性单纯性苔藓(lichen simplex chronicus, LSC)是一种常见的妇科疾病，常导致外阴皮肤瘙痒[1]。目前临床治疗方式有一般治疗、药物治疗、物理治疗及手术治疗。药物治疗常采用皮质醇激素，但疗程长、患者依从性差，长期使用可能导致皮肤萎缩；手术治疗可导致皮肤粘连，一般不采用此法。物理治疗有光疗法、经皮神经电刺激疗法、聚焦超声治疗等[2-4]，而聚焦超声治疗具有疗效好、复发率低，治疗时间短、一般仅需治疗1次等优点[5]。

P物质(substance P, SP)是由11个氨基酸残基组成的神经肽，属于速激肽家族成员，大量研究[6]证实SP是一种瘙痒介质，参与多种瘙痒性皮肤病的致病过程。肥大细胞广泛存在于皮肤中，是皮肤速发型过敏反应、宿主防御性免疫反应、炎症反应过程中的主要效应细胞[7]。1954年Salley[8]首次使用二甲基苯并蒽(7,12-Dimethylbenzanthracene, DMBA)成功诱导地鼠颊囊黏膜白斑，之后该模型成为口腔黏膜白斑的经典模型。由于口腔黏膜白斑与LSC 病理学表现相似，故本研究参考口腔黏膜白斑模型的造模方法，建立雌性SD大鼠LSC模型，并采用聚焦超声进行治疗，旨在观察聚焦超声对LSC模型大鼠的治疗效果及治疗前后大鼠外阴皮肤组织中肥大细胞、SP和P物质受体[神经激肽1受体(neurokinin-1 receptor, NK1-R)]的变化。

1 材料与方法

1.1实验动物 雌性SD大鼠40只，体质量140～160 g，6～8周龄，由重庆医科大学实验动物中心提供。

1.2试剂与仪器 二甲基苯并蒽(Sigma公司)，丙酮溶液(上海化学试剂公司)，甲苯胺蓝(上海阿拉丁)，SP单抗( Novus公司)，P物质受体抗体(北京博奥森)，PV900、PV9002、DAB(北京中杉金桥)。海极星©CZF 型超声波妇科治疗仪由重庆海扶医疗科技股份有限公司研制。

1.3实验方法

1.3.1动物模型的建立及分组 备皮消毒大鼠外阴皮肤后，用硬毛牙刷刷皮肤至充血。用勾线笔蘸0.5%DMBA丙酮溶液涂布于外阴皮肤；每周1、3、5 涂药，连续10周后外阴活检；确定均成功建模后40只大鼠按随机数字表分为治疗组(n=20)和对照组(n=20)。

1.3.2聚焦超声治疗 治疗组：1.0%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠后，备皮消毒，治疗区域涂超声耦合剂。CZF治疗参数：频率10 MHz；焦距2～4 mm；功率2 W；根据皮损的范围、程度和局部对超声辐照的反应确定辐照时间，一般为60～120 s。治疗头紧贴皮肤，辐照方式为连续直线辐照，速度5～10 mm/s。对照组：治疗过程与治疗组相同，但仪器无功率输出。

1.3.3观察指标 观察DMBA涂布后的皮肤变化(充血、粗糙、增厚、肿瘤)及聚焦超声治疗后皮肤变化(溃疡、瘢痕、皮下硬结)；观察及触诊大鼠全身是否有肿块、淋巴结是否肿大。治疗2、4周后取外阴皮肤组织，以4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色和甲苯胺蓝染色并于显微镜下观察。甲苯胺蓝染色后每个标本观察3张切片，每张切片于高倍镜(×400)下观察10个视野，取平均值，统计脱颗粒的肥大细胞，计算肥大细胞脱颗粒率。

1.3.4免疫组织化学检测 取两组治疗2周后的切片，采用超敏二步法作免疫组织化学染色(按照试剂盒说明书步骤进行)。SP抗体工作浓度为1∶100，NK1-R抗体工作浓度为1∶50。PBS代替一抗为阴性对照。SP以细胞膜和(或)胞浆出现棕黄色颗粒为阳性；NK1-R以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。采用IPP 6.0软件对切片的染色信号进行光密度分析，平均光密度值代表蛋白表达的强度。每张切片在高倍镜(×400)下随机选取5个视野，计算其平均光密度值。

1.4统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。两组治疗后有效率的比较采用χ2检验。计量资料以±s表示，采用Shapiro-Wilk法对数据进行正态性检验，符合正态性、方差齐性者采用t检验，不符合者采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1肉眼及病理观察 DMBA干预10周后，大鼠外阴皮肤颜色稍红、皮肤增厚、粗糙，弹性降低(图1A)，全身无肿块形成、淋巴结无肿大。治疗组：聚焦超声治疗后即刻外阴皮肤充血水肿明显、稍硬，无明显的皮下硬结，皮温升高；治疗2周后皮肤充血水肿消退，所有大鼠外阴皮肤完整，无溃疡形成(图1B)；治疗4周后除2只大鼠外阴形成乳头状瘤外，其余大鼠外阴皮肤恢复正常。对照组：聚焦超声治疗后即刻外阴皮肤无明显改变，治疗2周后4只大鼠外阴形成乳头状瘤，治疗4周后11只形成乳头状瘤(图1C)。

表1 两组外阴LSC大鼠的病理学检查结果(只,n=20)

组别治疗前正常LSC乳头状瘤治疗2周后正常LSC乳头状瘤治疗4周后正常LSC乳头状瘤治疗组020015501802对照组020021444511

图1 SD大鼠外阴皮肤形态学 A.造模成功的大鼠外阴皮肤、增厚、粗糙； B.治疗组治疗2周后大鼠外阴皮肤呈正常皮色，富有弹性； C.对照组治疗4周后，大鼠外阴形成乳头状瘤(箭)，表面可见出血坏死

图2 两组外阴组织中肥大细胞总数和脱颗粒率比较的柱形图 A.两组肥大细胞总数比较； B.两组肥大细胞脱颗粒率比较 ( *：与对照组比较， P<0.05)

病理学检查结果见表1。治疗2周后，治疗组75.00%(15/20)大鼠外阴皮肤转为正常，对照组10.00%(2/20)转为正常，差异有统计学意义(χ2=17.289，P<0.05)；治疗4周后，治疗组90.00%(18/20)大鼠外阴皮肤转为正常，对照组20.00%(4/20)转为正常，差异有统计学意义(χ2=19.798，P<0.05)。

2.2肥大细胞总数及脱颗粒率 紫红色肥大细胞主要位于真皮上层。对照组肥大细胞数量增多，边缘模糊不清，脱颗粒明显，治疗组经聚焦超声治疗后肥大细胞数量减少，脱颗粒现象不明显(图2、3)。

2.3SP和NK1-R的表达 对照组外阴皮肤中SP和NK1-R表达较多，呈棕黄色颗粒，着色较深，阳性表达主要位于表皮层；治疗组仅有少量表达，且着色较浅(图4)。与对照组相比，治疗组SP表达量明显降低(0.061 1±0.021 5 vs 0.025 9±0.011 0,t=6.526，P<0.05)、NK1-R的表达量也明显降低(0.060 7±0.012 5 vs 0.021 8±0.008 9,t=11.357，P<0.05)。

3 讨论

LSC是导致外阴瘙痒的原发病因之一，可继发于任何外阴瘙痒性疾病[9]。研究[10]显示，该病的常见诱因是出汗(41.9%)、远距离行走时大腿间的摩擦(9.5%)及心理压力(5.7%)。这些诱因或某些明确的瘙痒性疾病(外阴阴道假丝酵母菌病、硬化性苔癣等)的作用下可形成LSC，皮肤的屏障功能被破坏并刺激皮肤的周围神经末梢，进而发展为瘙痒-搔抓循环[11-12]，进一步导致皮肤增厚及苔癣样变，使瘙痒症状更严重，最终发展为顽固性瘙痒-搔抓循环。且瘙痒常在夜间加重，影响患者睡眠[9]。

聚焦超声是将体外低能量的超声波在穿过组织时进行聚焦，将焦点放置于靶区，利用超声波的热效应、机械效应和空化效应等使生物组织发生一系列变化来达到治疗目的。目前在我国，聚焦超声已广泛用于治疗外阴上皮内非瘤样病变，并具有较好的有效性及安全性。近期的一项研究[4]发现聚焦超声治疗LSC的有效率和治愈率分别为54.0%和44.1%，而复发率仅为8.4%。本研究参照口腔黏膜白斑的造模方法，成功建造了在形态学和病理学上与人外阴LSC相似的动物模型，且停止干预后4周，对照组55.00%(11/20)大鼠继续进展为乳头状瘤，25.00%(5/20)仍表现为LSC，仅20.00%(4/20)恢复正常。本研究观察时间内，无恶变表现的模型鼠，可能与DMBA浓度、作用时间和大鼠抵抗力有关。经聚焦超声治疗4周后的治疗组大鼠中，仅10.00%(2/20)继续进展为乳头状瘤，90.00%(18/20)外阴皮肤恢复正常，未出现溃疡和明显的瘢痕，提示聚焦超声可安全有效地阻断病变进展。

图3 外阴皮肤中肥大细胞的病理图(TB,×200) A.治疗组； B.对照组 (箭示肥大细胞) 图4 SP和NK1-R在外阴皮肤中的表达情况 A.对照组外阴皮肤中SP染色较深(箭)，主要位于表皮层(二步法，×400)； B.治疗组外阴皮肤中SP染色浅(箭)，且阳性细胞明显减少(二步法，×400)； C.对照组外阴皮肤中NK1-R染色较深(箭)，主要位于表皮层(二步法，×400)； D.治疗组外阴皮肤中NK1-R染色浅(箭)，且阳性细胞明显减少(二步法，×400)

研究[13]发现，LSC的主要病理改变是真皮层微血管病变引起的表皮退行性变。真皮内微血管闭塞或减少可能导致组织细胞缺氧，影响酪氨酸酶功能，减少黑色素合成，最终导致色素缺失和皮肤变白；同时还可能导致继发炎症并释放炎症介质，刺激神经末端引起外阴瘙痒。聚焦超声可有效治疗顽固性外阴瘙痒，研究[14]报道，经聚焦超声治疗12个月后，仅11.2%的患者仍存在明显的外阴瘙痒症状。但关于聚焦超声逆转疾病瘙痒症状的分子机制鲜见研究。

P物质是一种重要的瘙痒介质，其在特应性皮炎、银屑病等瘙痒性皮肤病中表达增加[15]。SP可与表皮层的NK1-R结合，通过激活传导痒觉的无髓C纤维上NK1受体直接引起瘙痒；还可促进白三烯B4释放或一氧化氮合成而引起或增强瘙痒[15]。目前研究[16]发现，NK-1R拮抗剂治疗特应性皮炎、结节性痒疹等瘙痒性皮肤病有效。皮内注射SP可诱导肥大细胞释放组胺，但组胺受体拮抗剂不能完全抑制SP诱发的皮肤瘙痒，且组胺受体抑制剂对瘙痒性疾病的疗效有限，提示肥大细胞释放的组胺可能在SP诱发的瘙痒中不起主要作用。但SP可诱导肥大细胞脱颗粒释放其他的炎症介质，如白三烯B4、前列腺素D2和TNF-α，这些炎性介质可进一步诱导感觉神经末梢释放SP，进一步激活更多的肥大细胞[17]。同时，肥大细胞脱颗粒释放的类胰蛋白酶，是瘙痒介质蛋白酶活化受体最有效的激活剂[18]。已有研究[19]发现，人LSC中脱颗粒肥大细胞增加，肥大细胞脱颗粒释放大量的细胞因子和趋化因子等，与疾病的发病机制有关。本研究中，建模成功的大鼠SP和NK1-R表达明显增加，且主要表达于表皮层，真皮层少量表达。对照组模型鼠肥大细胞增多，特别是脱颗粒的肥大细胞，而治疗组经聚焦超声治疗后组织中肥大细胞总数减少，且脱颗粒的肥大细胞也明显减少，同时，治疗组SP和NK1-R的表达均减少，考虑聚焦超声治疗通过改善局部微循环，改善微血管和神经末梢的营养状态和功能，促使神经末梢分泌的SP恢复正常，减轻局部的炎症介质的释放，从而减轻局部炎症反应[20]。

总之，聚焦超声治疗可有效改善外阴LSC患者的瘙痒症状；动物模型研究也证实聚焦超声治疗后肥大细胞、SP及NK1-R的表达改变可能与聚焦超声治疗有关。

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Effects of focused ultrasound on expression of substance P and neurokinkin 1 receptor in genital skin of SD rats with vulvar lichen simplex chronicus

YANGHuan,TANGHuajun,LIChengzhi*

(StateKeyLaboratoryofUltrasoundEngineeringinMedicineCo-FoundedbyChongqingandtheMinistryofScienceandTechnology,CollegeofBiomedicalEngineering,ChongqingKeyLaboratoryofBiomedicalEngineering,ChongqingCollaborativeInnovationCenterforMinimally-invasiveandNoninvasiveMedicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To explore the effects of focused ultrasound on the expression of Substance P (SP) and Neurokinin-1 receptor (NK1-R) in the genital skin of SD rats with vulvar lichen simplex chronicus (LSC). Methods Fourty female rat models of LSC were established by Sally method, and then the rats were randomly divided into treatment group (n=20) and control group (n=20). The rats in treatment group were treated by focused ultrasound, and those in control group received sham treatment. After focused ultrasound intervention, the histological changes of vulva were observed by using HE staining. The total number and the degranulated number of mast cells were identified by staining slides with toluidine blue. Immunohistochemistry was used to test the expression of SP and NK1-R. Differences between the groups were compared. Results After 2 weeks of focused ultrasound treatment, the rate of normal in treatment group was 75.00% (15/20) and that in control group was 10.00% (2/20), there was statistically significant between two groups (χ2=17.289，P<0.05). The total number and the degranulated number of mast cells, the expression of SP and NK1-R in treatment group were significantly lower than those in control group (allP<0.05). Conclusion Focused ultrasound can treat LSC through inhibiting SP and NK1-R expression, decreasing the total number and the degranulated number of mast cells and reducing the inflammatory reaction of tissues.

Ultrasonic therapy; Vulvar lichen simplex chronicus; Substance P; Receptors, neurokinin-1

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2011CB707900)。

杨欢(1989—)，女，四川南充人，在读硕士。研究方向：外阴上皮内非瘤样病变。E-mail: yanghuan1822@foxmail.com

李成志,重庆医科大学生物医学工程学院 省部共建国家重点实验室培育基地—重庆市超声医学工程重点实验室 重庆市生物医学工程学重点实验室 重庆市微无创医学协同创新中心，400016。E-mail: lichengzhi@cqmu.edu.cn

2016-08-16

2016-10-17

R711.72; R454.3

A

1672-8475(2016)12-0757-05

10.13929/j.1672-8475.2016.12.011