酶法制备板栗缓慢消化淀粉的工艺优化

赵 媛 吕 佼 邱增莲 欧阳杰 王建中 王丰俊

(北京林业大学生物科学与技术学院 林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京 100083)

酶法制备板栗缓慢消化淀粉的工艺优化

赵 媛 吕 佼 邱增莲 欧阳杰 王建中 王丰俊

(北京林业大学生物科学与技术学院 林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京 100083)

以板栗淀粉为原料，采用普鲁兰酶进行脱支处理制备缓慢消化淀粉(SDS)，通过单因素试验及响应面法优化制备工艺，以提高SDS的含量。制备板栗缓慢消化淀粉的最优工艺条件是：淀粉乳质量分数8%，普鲁兰酶浓度8.90 PUN/g淀粉，酶作用时间6.3 h，4 ℃回生52.2 h。在最佳工艺条件下，通过葡萄糖氧化酶法进行测定，酶改性的板栗淀粉中缓慢消化淀粉质量分数可达41.91%(预测值42.31%)，并较板栗原淀粉中缓慢消化淀粉含量提高了5.43倍。试验表明，普鲁兰酶脱支处理是制备板栗缓慢消化淀粉的有效方法。

板栗 缓慢消化淀粉 普鲁兰酶 响应面优化

淀粉是人类生理能量和营养摄入的主要来源之一，可通过人体小肠的消化吸收提供能量。根据淀粉的生物可利用性，Englyst等[1]将淀粉分为3类：易消化淀粉(ready digestible starch, RDS)、缓慢消化淀粉(slowly digestible starch, SDS)和抗性淀粉(resistant starch, RS)。其中缓慢消化淀粉(SDS) 从营养学角度定义为在 pH 5.2 和 37 ℃条件下，20～120 min内被混合酶(胰 α-淀粉酶、糖化酶与转化酶)消化的淀粉片断。近年来，抗性淀粉(RS)的研究已逐渐成熟，而缓慢消化淀粉(SDS)因其可维持餐后血糖并持续提供能量、增加饱腹感，有利于对糖尿病、心脑血管疾病及肥胖病人的病情进行调节和控制的特点[2]，日益成为食品科学领域的研究热点，有学者研究了采用物理、化学及生物酶改性不同植物源淀粉来制备缓慢消化淀粉的方法[3-7]。板栗作为良好的淀粉资源，目前开发利用较少，已有的研究包括采用化学方法进行淀粉磷酸酯化的改性和低压处理对淀粉性质改变的研究[8-10]，而针对淀粉消化能力的研究甚少，因此板栗可作为研究淀粉改性加工的原材料，一方面板栗淀粉中含有较高的支链淀粉(54%～72%)[11]，另一方面，板栗原淀粉中RS含量虽很高，但经加热糊化多转变为RSD，采用酶法脱支处理及老化回生可高效促进淀粉重结晶，提高淀粉中SDS的含量。因此，本研究以板栗淀粉为主，采用普鲁兰酶进行脱支处理，通过研究酶作用体系的条件探索板栗缓慢消化淀粉的最佳制备工艺，为板栗淀粉在食品行业的开发应用及SDS产品的商业化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

板栗：河北省迁西县燕山早丰；Type VI-B 猪胰α-淀粉酶(19.6 U/mg)：日本和光纯药wako公司；GL-L NEW 黑曲霉糖化酶(100 000 U/g)：北京奥博星生物技术有限责任公司；普鲁兰酶(1 350 PUN/mL) (1 PUN是指在pH 5.0、温度40 ℃、作用0.2%普鲁兰30 min的标准条件下每分钟水解普鲁兰释放出带有相当于1 μmol分子量葡萄糖还原力的还原碳水化合物的酶的数量)：诺维信公司；E1010葡萄糖氧化酶(GOD)法测定试剂盒：普利莱基因技术有限公司。

KHB-ST-360酶标仪：上海科华生物工程股份有限公司；SHA-BA水浴恒温振荡器：金坛市荣华仪器制造有限公司；BLENDER800S组织破碎机：WARING COMMERCIAL；JB-3型定时双向磁力恒温搅拌器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；TD5A台式低速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；SCIENTZ-12N冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 板栗淀粉的提取工艺

板栗→去壳去衣→破碎→0.2%NaOH溶液浸泡12 h→依次过80目、200目筛除渣→滤液离心(4 000 r/min，5 min)→蒸馏水水洗沉淀3～4次→-60 ℃冷冻干燥→板栗淀粉

1.2.2 板栗缓慢消化淀粉的制备工艺

参照Guraya等[12]、熊珊珊[13]的方法，设计板栗缓慢消化淀粉的制备流程：

用pH 5.4的磷酸盐缓冲液配制一定质量分数的淀粉乳(3.25%～10.25%)→100 ℃水浴，充分糊化1 h→冷却至57.5 ℃→加入普鲁兰酶[2～18 PUN/g淀粉]→57.5 ℃，180 r/min水浴振荡(3～24 h)→100 ℃ 30 min灭酶→冷却→加入无水乙醇促沉淀→4 ℃回生(12～72 h)→离心(4 000 r/min, 8 min)去上清液→水洗3次→取沉淀冷冻干燥→板栗缓慢消化淀粉(SDS)。

1.2.3 葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量标准曲线的绘制

按照E1010葡萄糖氧化酶(GOD)法测定试剂盒说明中标准品的稀释和测定方法，以吸光度为横坐标x，葡萄糖含量为纵坐标y绘制标准曲线，得曲线方程y=235.53x+0.330 9(R2=0.999 9)。

1.2.4 缓慢消化淀粉含量的测定

根据缪铭等[14]改进优化的Englyst体外SDS含量分析法进行淀粉消化模拟试验：称取200 mg 淀粉样品置于50 mL锥形瓶中，添加15 mL pH 5.2 的0.2 mol/L醋酸钠缓冲液，混匀后加入10 mL的猪胰α-淀粉酶(290 U/mL)和糖化酶(15 U/mL)，置于37 ℃恒温水浴下振荡(180 r/min) 并准确计时。水解20min 或120 min 后取出0.5 mL 水解液加4 mL无水乙醇加热灭酶，冷却后定容离心，取上清液用葡萄糖氧化酶法在492 nm下比色测定产生的葡萄糖含量，推算缓慢消化淀粉的含量。具体计算公式：

RDS(%)=(G20-FG)×0.9/TS

SDS(%)=(G120-G20)×0.9/TS

RS(%)=[TS-(RDS+SDS)]/TS

式中：G20为淀粉酶水解 20 min 后产生的葡萄糖含量/mg；FG为酶水解处理前淀粉中游离葡萄糖含量/mg；G120为淀粉酶水解120 min 后产生的葡萄糖含量/mg；TS为样品中总淀粉含量/mg。

1.2.5 单因素试验

选择普鲁兰酶浓度、淀粉乳质量分数、酶作用时间、4 ℃回生时间为单因素变量，考察各因素对缓慢消化淀粉含量的影响，确定各因素的最佳水平，为响应面设计因素提供数据支持。

1.2.5.1 普鲁兰酶浓度对制备所得板栗SDS含量的影响

配制15 mL质量分数为6.75%的淀粉乳6份，普鲁兰酶浓度分别取0、2、6、10、14、18 PUN/g淀粉6个水平，在57.5 ℃ 180 r/min条件下水浴振荡6 h，灭酶加乙醇，4 ℃回生48 h，离心洗涤冻干，考察普鲁兰酶浓度对板栗SDS含量的影响。

1.2.5.2 淀粉乳质量分数对制备所得板栗SDS含量的影响

取质量分数分别为3.25%、5.00%、6.75%、8.50%、10.25% 5个水平的淀粉乳各15 mL，加入10 PUN/g淀粉的普鲁兰酶，在57.5 ℃ 180 r/min条件下水浴振荡6 h，灭酶加乙醇，4 ℃回生48 h，离心洗涤冻干，考察淀粉乳质量分数对板栗SDS含量的影响。

1.2.5.3 不同酶作用时间对制备所得板栗SDS含量的影响

配制15 mL质量分数为6.75%的淀粉乳6份，加入10 PUN/g淀粉的普鲁兰酶，在57.5 ℃ 180r/min条件下水浴振荡，酶作用时间分别取0、3、6、9、12、24 h 6个水平，灭酶加乙醇，4 ℃回生48 h，离心洗涤冻干，考察酶作用时间对板栗SDS含量的影响。

1.2.5.4 不同回生时间对制备所得板栗SDS含量的影响

配制15 mL质量分数为6.75%的淀粉乳6份，加入10 PUN/g淀粉的普鲁兰酶，在57.5 ℃ 180 r/min条件下水浴振荡6 h，灭酶加乙醇，4 ℃回生，回生时间分别取12、24、36、48、60、72 h 6个水平，结束后离心洗涤冻干，考察回生时间对板栗SDS含量的影响。

1.2.6 响应面试验

为分析各影响因素间的交互作用对制备所得板栗缓慢消化淀粉(SDS)含量的影响，在单因素试验的基础上，根据 Box-Benhnken 中心组合试验设计原理，运用 Design Expert 8.0 软件设计响应面试验，如表1所示，分别选取以普鲁兰酶浓度、淀粉乳质量分数、酶作用时间、回生时间为试验因素，以酶改性后板栗淀粉中缓慢消化淀粉(SDS)的含量为响应值，确定最佳制备条件。

表1 响应面试验因素与水平

1.2.7 不同板栗淀粉消化性能的测定与对比

为更好地了解普鲁兰酶作用板栗淀粉后淀粉消化性能的变化，采用响应面试验最优条件制备的板栗淀粉与板栗原淀粉、板栗糊化淀粉进行消化性能的对比，分析板栗淀粉中易消化淀粉(RDS)、缓慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)含量的变化。

1.3 数据分析

数据均采用Excel 2013，Design Expert 8.0 软件进行整理分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验测定结果

2.1.1 普鲁兰酶浓度对制备所得板栗SDS含量的影响

由图1可得，经普鲁兰酶脱支反应后所得淀粉，其缓慢消化淀粉的含量较未加入脱支酶的缓慢消化淀粉有所提升，且缓慢消化淀粉的含量随着加入酶浓度的增加而先呈现增加趋势，在6 PUN/g淀粉时达到最大，随着浓度的继续增加，SDS含量反而有所下降，可能原因为高浓度的普鲁兰酶脱支淀粉支链形成较多小分子链，这些小分子链在回生重结晶过程中重新排列组合，形成紧密结晶区，使得SDS含量下降，抗性淀粉(RS)含量上升。这个结果趋势与缪铭等[14]研究的结论相一致。

图1 普鲁兰酶浓度对板栗淀粉消化性能的影响

2.1.2 淀粉乳质量分数对制备所得板栗SDS含量的影响

由图2可以看出，相同酶作用条件下，不同淀粉乳质量分数的样品所产生的SDS含量是不一样的，并在淀粉乳质量分数为6.75%时所得板栗淀粉中SDS含量最高。因为不同质量分数的淀粉乳，其含水量影响淀粉的糊化和回生，含水量越高，水分子参与重结晶的越多，有利于不定型区的形成，而水分含量相对较少时，淀粉回生慢，能够形成更加紧密的结晶结构，导致缓慢消化淀粉的减少，抗性淀粉的增加，这与丁文平等[15]研究含水量对大米淀粉糊化和回生的影响得出的水分子含量越低参与抗酶解能力越强的结论有一定相似之处，当然，具体原因应在之后的研究中具体开展。

图2 淀粉乳质量分数对板栗淀粉消化性能的影响

2.1.3 不同酶作用时间对制备所得板栗SDS含量的影响

由图3可得，SDS 含量随着脱支时间的延长呈先增加后降低的趋势，在酶作用6 h时达到最高。这说明恰当的脱支时间可以增加SDS含量，如果过长，不利于缓慢消化淀粉不定型区的形成，会导致淀粉链的进一步水解重结晶，形成较多的抗性淀粉。这与Guraya等[12]报道的酶解蜡质玉米淀粉最佳酶解时间4 h以及Shin等[16]报道的蜡纸高粱淀粉最佳酶解时间为8 h的结论相一致。

图3 酶解时间对板栗淀粉消化性能的影响

2.1.4 不同回生时间对制备所得板栗SDS含量的影响

在预试验中，探究了回生时间从0 h起板栗淀粉中SDS含量的变化是持续上升的。在确定最佳回生时间时，如图4所示，主要考察淀粉溶液在以12 h为单位的回生时间梯度下，所得板栗SDS含量随着时间延长而变化，并在48 h处达最大值。根据Fredri-ksson等[17]的研究表明，淀粉回生分为短期回生和长期回生，短期回生主要是由直链淀粉的胶凝有序和结晶所引起的；长期回生(以天计)则主要是由支链淀粉外侧链的重结晶所引起的，该过程是一个缓慢长期的过程，能够形成较多的缓慢消化淀粉。当回生时间超过48 h后，SDS含量有所下降，进一步计算得淀粉中抗性淀粉含量增加，可能原因是淀粉分子链间继续发生了相互作用。

图4 回生时间对板栗淀粉消化性能的影响

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 响应面试验数据结果见表2。

表2 响应面试验设计方案及结果

2.2.2 模型建立及显著性检验

采用Design Expert 8.0软件，对表 2 中的试验数据进行多元回归拟合，得出板栗缓慢消化淀粉(SDS)含量Y的二次多项回归模型为：

Y=39.64+3.49A+2.77B+1.78C+1.70D+2.45AB-1.16AC+1.35AD-0.58BC-0.39BD+2.00CD-3.90A2-2.94B2-5.45C2-3.76D2

对方程进行方差分析，结果如表3所示。

表3 回归方程方差分析表

注：**代表 0.01 显著水平。

模型的一次项A、B、C、D影响极显著，交互项AB、CD影响极显著，二次项A2、B2、C2、D2影响达极显著水平，通过回归分析可知，各因素对板栗缓慢消化淀粉(SDS)的含量均有显著性影响，且影响顺序为普鲁兰酶浓度(A)>淀粉乳质量分数(B)>酶作用时间(C)>回生时间(D)。

2.2.3 响应面分析及最优条件的确定

运用Design Expert 8.0 软件的响应面优化设计，将4个因素两两交互作用进行比较后可知，AB、CD交互作用极显著。

根据模型分析计算可得，制备板栗缓慢消化淀粉的最佳工艺参数：淀粉乳质量分数8.04%，普鲁兰酶浓度8.89 PUN/g淀粉，酶作用时间6.33 h，4 ℃回生52.16 h，SDS含量(质量分数)预测最大值为42.31%。为便于操作，将制备工艺参数修正为：淀粉乳质量分数8%，普鲁兰酶浓度8.90 PUN/g淀粉，酶作用时间6.3 h，4 ℃回生时间52.2 h，经过3次验证试验得改性后板栗SDS质量分数的平均值为41.91%，实际值与预测值的相对误差为0.95%，说明模型优化所得参数可靠，可用于板栗缓慢消化淀粉(SDS)的工艺优化应用。

2.3 板栗淀粉酶法处理前后消化性能的对比

由图5可得，经普鲁兰酶改性处理后的板栗淀粉，SDS的含量较板栗原淀粉、糊化淀粉中缓慢消化淀粉(SDS)含量提高了5.43倍和1.25倍。板栗糊化淀粉的易消化淀粉(RSD)质量分数高达70.05%，较原淀粉增加了58.43%，因为板栗原淀粉中抗性淀粉一般为具有致密结构和部分结晶结构的RS2型[18]，其抗性随着糊化完成而消失，形成有利于消化吸收的无定型结构，消化性能得以提升；通过酶法改性的淀粉，不仅有无定型区的形成过程，而且在脱支后经回生处理，促进了利于SDS形成的重结晶，因此，改性后的板栗淀粉其SDS的含量较原淀粉和糊化淀粉都有相应的增加，而RS的含量较原淀粉减少。

图5 板栗淀粉酶法处理前后消化性能的对比

3 结论

通过单因素和响应面试验，建立了酶法制备板栗缓慢消化淀粉最佳工艺的模型，并确定了酶法制备高SDS含量的改性板栗淀粉的工艺条件。得出制备板栗缓慢消化淀粉的最优工艺条件：淀粉乳质量分数8%，普鲁兰酶浓度8.90 PUN/g淀粉，酶作用时间6.3 h，4 ℃回生52.2 h。在最佳工艺条件下，改性后板栗淀粉中缓慢消化淀粉质量分数可达41.91%(理论值42.31%)，并较板栗原淀粉、糊化淀粉中缓慢消化淀粉含量提高了5.43倍和1.25倍。此外，本研究对板栗缓慢消化淀粉的形成机理及抗性淀粉在改性中的含量变化进行了简单的比较和分析，下一步应针对研究中酶解和回生过程中直/支链比的变化、SDS形成的机理以及如何将该工艺应用到板栗淀粉的食品加工中做进一步的研究与探索。

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Optimization of the Process on the Formation of Slowly Digestible Starch from Chestnut Starch

Zhao Yuan Lü Jiao Qiu Zenglian Ouyang Jie Wang Jianzhong Wand Fengjun

(Beijing Forestry University, College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing 100083)(Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety, Beijing 100083)

Chestnut starch as raw materials was debranched with pullulanase to prepare slowly digestible starch (SDS). Single factor experiment and the response surface analysis were carried out in this paper to improve SDS content. The results indicated that the optimum preparation conditions were obtained as follows: the starch suspension mass fraction 8%, the pullulanase concentration 8.90 PUN/g starch, hydrolysis time 6.3 h and cooling at 4 ℃ for 52.2 h. Under the optimum conditions, determined by glucose oxidase method, the content of SDS (mass fraction) in modified chestnut starch was 41.91% (predicted value was 42.31%). Compared with the content of SDS in fresh chestnut starch, it was increased 5.43 times. The test indicated that pullulanase debranching treatment was an effective method for preparing slowly digestible starch.

chestnut starch, slowly digestible starch, pullulanase, response surface optimization

TS235.4

A

1003-0174(2016)10-0108-06

林业公益性行业科研专项(201204401)

2015-01-16

赵媛, 女，1988年出生，硕士，农产品加工与贮藏工程

王丰俊，男，1975年出生，副教授，林产品加工利用