miR-200b靶向VEGF抑制肺癌细胞侵袭

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(湖北医药学院附属十堰市太和医院， 湖北 十堰 442000)

·基础医学·

miR-200b靶向VEGF抑制肺癌细胞侵袭

罗卫民，罗湘玉，郭家龙，林称意，张军*

(湖北医药学院附属十堰市太和医院， 湖北 十堰 442000)

目的探讨miR-200b是否通过靶向调控血管内皮生长因子(VEGF)抑制人非小细胞肺癌细胞侵袭，以揭示miR-200b的抑瘤机制。方法运用qRT-PCR检测miR-200b在非小细胞肺癌和癌旁正常肺组织中的表达；将非小细胞肺癌A549细胞分为miR-200b mimics组、miR-200b inhibitors组、scramble组、VEGF-siRNA组和control-siRNA组，分别将miR-200b mimics、miR-200b inhibitors、scramble、VEGF-siRNA、control-siRNA转染于A549细胞；采用Western blot检测A549细胞中VEGF蛋白表达，采用Transwell侵袭实验分别检测A549细胞侵袭能力。结果qRT-PCR检测结果显示，miR-200b在A549、16HBE细胞的表达分别为0.704±0.053、1.582±0.071，两者比较，差异有显著性(P<0.01)；Western blot结果显示，外源过表达miR-200b或沉默VEGF能明显下调A549细胞中VEGF蛋白的表达水平；Transwell侵袭实验显示，转染miR-200b mimics或沉默VEGF 36 h后穿过基底膜的细胞数分别为(127±6)和(136±8)，与对照组(189±14)比较能明显抑制A549细胞的穿膜能力(P<0.05)，而转染miR-200b inhibitors可拮抗VEGF-siRNA对A549细胞的侵袭抑制作用。结论miR-200b通过靶向调控VEGF抑制人非小细胞肺癌细胞侵袭。

miR-200b； 非小细胞肺癌； 血管内皮生长因子； 侵袭

MicroRAN是一类高度保守，长度约为22个核苷酸的小RNA分子，通过与靶基因mRNA 3′ UTR结合，在转录后水平调控基因的表达。miRNA参与细胞增殖、凋亡、分化、衰老等多种生理过程。miRNA的表达异常与多种肿瘤的发生和发展密切相关。研究显示，miR-200b在多种肿瘤中表达异常，如胃癌、胶质瘤、乳腺癌中表达下调类似抑癌基因样作用[1-3]。李光剑等[4]研究显示，miR-200b在肺癌中的表达差异可作为早期诊断云南宣威地区非吸烟女性肺癌患者的生物标志物。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种重要的血管生成调控因子，其高表达可促使血管内皮细胞的分裂与增殖，从而促进新生血管形成。研究显示，VEGF在非小细胞肺癌患者中的表达明显高于健康人群，且其高表达与肺癌恶性程度以及淋巴结转移密切相关[5]。本文拟通过qRT-PCR、免疫印迹、Transwell侵袭实验检测miR-200b在肺癌组织和细胞中的表达，明确miR-200b在肺癌细胞中的作用及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1病例资料收集2012年5月～2013年11月期间本院收治并确诊为非小细胞肺癌的患者24例，中位年龄58(39～71)岁，男性14例，女性10例；所有非小细胞肺癌患者术前均未行放化疗等抗肿瘤治疗。所有癌组织标本经HE 染色并经两名以上病理学专家确诊，所取癌旁正常组织距癌缘>5 cm，经HE染色证实为非癌组织。

1.2主要材料非小细胞肺癌A549细胞株和人支气管上皮细胞16HBE由中山大学肿瘤研究所惠赠；Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司(美国)；基质胶与Transwell小室购于康宁公司(美国)；miR-200bmimics、inhibitors、scramble、VEGF-siRNA、control-siRNA序列均由Ambion公司设计合成；RNA抽提试剂盒购于Ambion公司(美国)；VEGF和β-actin抗体购于Santa Cruz公司(美国)。

1.3方法

1.3.1 细胞分组与处理 将非小细胞肺癌A549细胞分为miR-200b mimics组、miR-200b inhibitors组、scramble组、VEGF-siRNA组和control-siRNA组，分别将miR-200b mimics、miR-200b inhibitors、scramble、VEGF-siRNA、control-siRNA转染于A549细胞。

1.3.2 qRT-PCR 用RNA抽提试剂盒抽提A549中总RNA，逆转录合成cDNA 于80 ℃冰箱保存。miR-200b-

(forward)5′-CTCCCTAAAGCCTCCCACC-3′,(reverse) 5′-AGGGCTTTCTGCTGTTGTCC-3′;U6-(forward)5′-GCGGTCCGTGAA GCGTTC-3′,(reverse)5′-GTGTGCGGTCCGAGGT-3′，PCR扩增反应体系为20 μL，其中包括MiR-PCR primers(5 mmol/L)0.4 μL，miRNA RT product 2.0 μL，Taq DNA polymerase 5 U/μL)0.2 μL，2×SYBR Mix 10 μL，灭菌蒸馏水7.4 μL。循环体系为:95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，一共40个循环。以U6 snRNA为内参，所测定的miR-200b的相对表达量采用2-ΔΔCT法分析。

1.3.3 Western blot 将miR-200b mimics、scramble、VEGF-siRNA、control-siRNA,分别转染于A549细胞中，48 h后提取细胞总蛋白，每组取等量样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后转膜，封闭1 h，加入VEGF抗体或β-actin抗体，4 ℃过夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL发光，X片曝光、显影、定影。

1.3.4 Transwell实验 将基质胶稀释液铺置在transwell小室中，放置成膜。取100 μL细胞稀释液接种至小室上腔，取500 μL含10%胎牛血清培养基添加至下腔，小室放置在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养36 h后取出，擦弃小室上层细胞并用4%甲醛固定，0.1%结晶祡染色，PBS液洗涤，晾干。光学显微镜下观察并随机选取4个高倍视野进行细胞计数，取平均值。

2 结 果

2.1 miR-200b在非小细胞肺癌组织中的表达水平

提取非小细胞肺癌和癌旁正常肺组织中的总RNA，以U6 snRNA为内参采用qRT-PCR法检测非小细胞肺癌和癌旁正常肺组织中miR-200b的表达水平。图1所示，非小细胞肺癌和癌旁正常肺组织总RNA的18S和28S条带清晰，A260/A280比值大于1.93，符合RT-PCR要求。以2-ΔΔCT表示miR-200b的表达水平，分析得出在24例非小细胞肺癌组织中miR-200b的平均表达值为0.704±0.053，癌旁正常肺组织中miR-200b的平均表达值为1.582±0.071，两者相比，差异具有统计学意义(图2，P<0.01)。

图1 非小细胞肺癌和癌旁正常肺组织的总RNA电泳图 M：Marker；1：非小细胞肺癌；2：癌旁正常肺组织

2.2非小细胞肺癌细胞中miR-200b对VEGF蛋白表达的影响Western blot结果显示，转染miR-200b mimics组和VEGF-siRNA组VEGF蛋白表达水平较阴性对照组明显降低(图3)。即在非小细胞肺癌A549细胞中miR-200b能下调VEGF蛋白的表达。

2.3 miR-200b对非小细胞肺癌细胞株A549细胞侵袭的影响Transwell结果显示，转染miR-200b mimics组和VEGF-siRNA组36 h后非小细胞肺癌细胞株A549细胞穿过基质胶的细胞数量分别为(127±6)和(136±8)，与各自对照组(189±14、195±11)比较，差异均具有统计学意义(P<0.01，图4，表1)。而miR-200b inhibitors联合VEGF-siRNA共转染组A549细胞穿过基质胶的细胞数为(182±12)与对照组相比较，差异则无统计学意义。提示外源高表达miR-200b或沉默VEGF表达均能抑制非小细胞肺癌A549细胞的侵袭。而miR-200b inhibitors可拮抗VEGF-siRNA对A549细胞的侵袭抑制作用。

图2 qRT-PCR检测结果 A:非小细胞肺癌组扩增曲线；B:非小细胞肺癌组溶解曲线;C:正常肺组织组扩增曲线；D:正常肺组织组溶解曲线

图3 Western blot检测miR-200b对VEGF蛋白的影响

表1miR-200b对非小细胞肺癌细胞株A549细胞侵袭的作用(n=3)

组别穿膜细胞数scramble189±14miR-200bM127±6acontrol-siRNA195±11VEGF-siRNA136±8bmiR-200bI+VEGF-siRNA182±12

与scramble比较，a：P<0.05；与control-siRNA比较，b：P<0.05

图4 Transwell侵袭实验检测miR-200b对A549细胞侵袭能力的影响

3 讨 论

肺癌的发病率和死亡率目前在所有恶性肿瘤中均居首位[6]。肺癌的发生和发展涉及多因素协同长期作用并与多条信号通路改变相关[7]。随着环境恶化，肺癌的发病率和死亡率呈逐年增加趋势。在肺癌的分类中以非小细胞肺癌(NSCLC)为主，大约占80%以上，其早期诊断困难，故大多数非小细胞肺癌患者在确诊时已达晚期阶段。因此，有效治疗策略的开发成为当务之急。

miR-200家庭成员通过Zeb1、Ets-1、Suz12等转录因子发挥重要功能[8]。研究表明，miR-200家庭成员中miR-200b在肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移过程中发挥重要作用，对多种肿瘤具有抑制作用[9]。研究显示，在上皮性肿瘤中miR-200b可以调控EMT转化、细胞的周期与增殖以及细胞的耐药性[10]。miR-200b通过直接靶向E-cadherin转录抑制因子ZEB1 与 ZEB2的表达，使E-cadherin表达上调，从而抑制EMT转化[11]。由此可见miR-200b在多种肿瘤中发挥抑癌作用。本研究发现，miR-200b在肺癌细胞中表达下调，外源高表达miR-200b能明显抑制肺癌细胞的增殖与侵袭，提示miR-200b在肺癌细胞中具有抑癌作用。

VEGF 是参与肿瘤血管生成的重要调控因子之一，通过与血管内皮细胞特异性结合，刺激内皮细胞增殖，还可激活蛋白酶，使细胞外基质降解，有助于新生血管的延伸，为血管内皮细胞的迁移与肿瘤细胞的侵袭转移提供重要的形态学基础。VEGF高表达可使血管内皮细胞的分裂、增殖和迁移能力增强，其与肿瘤生长密切相关[12]。研究表明，VEGF在NSCLC中高表达与患者淋巴结转移与临床分期相关，表明VEGF 在NSCLC 的发展转移过程中发挥重要作用[13]。有研究显示VEGF是miR-200b直接调控的靶基因[14]。本研究发现在肺癌细胞中外源过表达miR-200b能下调VEGF蛋白的表达，而在肺癌细胞中沉默VEGF后，肺癌细胞的侵袭能力也明显减弱，而将miR-200b抑制剂与VEGF-siRNA共同转染于肺癌细胞，能逆转肺癌细胞的侵袭抑制作用。说明miR-200b可能通过靶向调控VEGF抑制肺癌细胞的侵袭。进一步提示VEGF是miR-200b下游的功能靶点，miR-200b可能通过下调VEGF的表达抑制肺癌细胞的侵袭。

综上，miR-200b可通过靶向VEGF抑制非小细胞肺癌细胞侵袭。miR-200b可能是非小细胞肺癌的潜在的治疗靶点，为今后该疾病的靶向治疗提供了新的切入点。

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miR-200bPromotesNon-smallCellLungCancerCellsInvasionbyTargetingVEGF

LUO Weimin,LUO Xiangyu,GUO Jialong,et al

(AffiliatedTaiheHospitalofHubeiMedicineCollege,shiyan,Hubei442000,China)

ObjectiveTo investigate whether miR-200b promotes cell invasion of non-small cell lung cancer cells by targeting VEGF,thus to reveal molecular mechanism that miR-200b functions as a tumor suppressor in non-small cell lung cancer.MethodsThe expression of miR-200b in non-small cell lung cancer and normal lung tissues was detected by qRT-PCR.Non-small cell lung cancer cell line A549 were divided into miR-200b mimics group,miR-200b inhibitors group,scramble group,VEGF-siRNA group as well as control-siRNA group.A549 cells were transfected with miR-200b mimics,scramble,VEGF-siRNA,control-siRNA,respectively.The expressions of VEGF protein in A549 cells was detected by Western blotting.The invasion ability of A549 cells were evaluated by Transwell invasion assays.ResultsqRT-PCR showed that miR-200b was significantly down-regulated in non-small cell lung cancer tissues (0.704±0.053) than normal lung tissues (1.582±0.071).Western blot showed that the level of VEGF protein was inhibited by restored miR-200b or knock-down VEGF in A549 cells.After transfection of miR-200b mimics or knock-down VEGF for 36 h,Transwell invasion assay showed that the number of cells through the basement membrane was(127±6),(136±8),compared with the control group(189±14),it can significantly suppress the invasion of A549 cell (P<0.01).However,miR-200b inhibitors could antagonize the role of VEGF-siRNA in A549 cells.ConclusionmiR-200b suppresses cell invasion by targeting VEGF in non-small cell lung cancer.

MiR-200b; non-small cell lung cancer; VEGF; invasion

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.03.008

2015-12-21；

2016-05-03

湖北省教育厅科学研究计划指导性项目(B2015477).

*通讯作者，E-mail:dengmin2006@163.com.

R734.2

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蒋湘莲)