抗菌肽天蚕素B基因在纳豆芽胞杆菌中的表达

张 双， 骆超超， 武彩霞， 高学军*

(1.东北农业大学 农业生物功能基因重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.河北北方学院 生命科学研究中心，河北 张家口 075000)



抗菌肽天蚕素B基因在纳豆芽胞杆菌中的表达

张 双1， 骆超超1， 武彩霞2， 高学军1*

(1.东北农业大学 农业生物功能基因重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.河北北方学院 生命科学研究中心，河北 张家口 075000)

抗菌肽是生物体内经诱导产生的一类具有生物活性的小分子多肽。天蚕素B(Cecropin B)是最早从天蚕体内分离得到的一种热稳定的可溶性多肽，在已分离的众多抗菌肽中抗性较强。纳豆芽胞杆菌具有优良的益生特性，本研究选择枯草芽胞杆菌的一种表达载体pHT43，将抗菌肽天蚕素B基因导入纳豆芽胞杆菌中，验证其在目的菌中是否能够表达和稳定传代以及进行抗菌活性分析。结果表明，天蚕素B基因在纳豆芽胞杆菌中表达，并能稳定传代，能够提高纳豆芽胞杆菌的抑菌活性，抗金黄色葡萄球菌的活性优于干酪乳杆菌和枯草芽胞杆菌。本研究为该重组菌作为饲料添加剂的应用提供了技术基础。本文首次报道天蚕素B在纳豆枯草芽胞杆菌中表达。

天蚕素B；纳豆芽胞杆菌；表达；传代；抑菌

益生菌又称微生态制剂，是由一种或多种有益微生物及代谢产物组成，可供人类或动物直接食用和喂食的活菌制剂[1]。纳豆芽胞杆菌属于益生菌的一种，是枯草芽胞杆菌的一个亚种，在我国已被列入农业部公布允许使用的饲料级微生物添加剂[2]。其作为饲料添加剂有着提高饲料转化率、促进仔猪生长、提高畜禽免疫能力和抗应激能力等诸多功能[3]。抗菌肽具有抗菌谱广、效果稳定、无残留、不易产生耐药性等优点，属一类环保型饲料添加剂，因而抗菌肽作为一种新型饲料添加剂是目前饲料工业上的一个新的研发方向[4]。研究发现，天蚕素B抗菌肽在抗菌肽中活性较强[5-6]，近年来国内外先后报道了有关抗菌肽基因以及与其他相关基因融合的克隆和表达，如Florack等[6]用天蚕素抗菌肽B基因转化到烟草中，发现其mRNA表达量提高；杜淑环等[7]将天蚕素抗菌肽B及其串联体引入到了紫花苜蓿中；王秀青等[8]将抗菌肽天蚕素B基因及其串联体导入毕赤酵母中表达。但尚未见将抗菌肽基因导入纳豆芽胞杆菌的报道。本研究将外源的天蚕素B基因转入纳豆芽胞杆菌中，以验证纳豆芽胞杆菌能否表达抗菌活性以增强其作为饲料添加剂的应用价值，为该重组菌作为饲料添加剂的应用提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2 仪器与试剂 凝胶成像系统、微波炉、电泳槽、稳压稳流电泳仪、PCR仪、电子天平、离心机、超净工作台、电热恒温培养箱、光学显微镜、电热恒温鼓风干燥箱、高速冷冻离心机、pH计等。PrimeSTAR®HS DNA Polymerase、T4 DNA连接酶、AatII、XbaI、蛋白质Marker、DNA Marker购自大连宝生物科技有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Axygen公司；溶菌酶、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside, IPTG)、氨苄青霉素、氯霉素购自上海生工生物工程公司；引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成；其他试剂均为进口或国产分析纯，培养基使用LB培养基。

1.2 方法

1.2.1 天蚕素B基因PCR扩增 根据相关文献和NCBI报道的天蚕素B(Cecropin B,CB)的基因序列(基因登录号：NM_001043995.1)，设计扩增该基因序列的引物，其中在上下游引物的5′端分别插入XbaI和AatII酶切位点(下划线标示)。上游引物：5′-GCTCTAGAAGGTGGAAGATCTTCAAGAAAAT-3′，下游引物：5′-CGGACGTCTATGGCTTTAGCTGAACCGAG-3′。以本实验室保存的重组质粒pMD-18T-CB为模板，进行天蚕素B基因的PCR扩增。反应条件：98 ℃预变性3 min，98 ℃变性30 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，30个循环；72 ℃总延伸10 min；4 ℃保温。扩增完毕后，取其中5 μL反应产物进行1%的琼脂糖凝胶验证。

1.2.2 纳豆芽胞杆菌中重组表达质粒pHT43/CB构建以及转化 按照Axygen凝胶回收试剂盒的说明操作，对PCR扩增产物回收纯化。并对纯化后的产物及pHT43载体分别进行双酶切反应，之后用T4 DNA连接酶连接两产物，构建出重组载体pHT43/CB，按照枯草芽胞杆菌感受态制备方法处理纳豆芽胞杆菌，即通过化学转化方法将重组载体转化至纳豆芽胞杆菌中[9-10]，于LB培养基中培养，氯霉素抗性平板筛选。

1.2.3 纳豆芽胞杆菌中重组质粒鉴定 挑取单菌落于5 mL含氯霉素(25 μg/mL)的LB培养基中培养，提取质粒，用AatII和XbaⅠ进行双酶切鉴定，筛选得到阳性克隆子[11]。将阳性克隆子进行核苷酸序列测定(由上海华大基因公司完成)，用生物信息学软件将所得序列和NCBI发布的序列进行比对分析。

1.2.4 重组质粒pHT43/CB在纳豆芽胞杆菌中蛋白的水平表达 将携带重组表达质粒pHT43/CB的纳豆芽胞杆菌在含有氯霉素的LB培养基中培养至OD值为0.6～0.8，加入1 mmol/L的IPTG，37 ℃诱导24 h，获取蛋白样，进行Tricine-SDS-PAGE电泳，其浓缩胶浓度为5%，电泳时电压为30 V，分离胶浓度16%，电压为200 V[12]。电泳结束后，进行Western-bloting验证[13]。

1.2.5 重组质粒在纳豆芽胞杆菌中的稳定性 参考经典质粒遗传稳定性测定方法，经适当修改后，在有选择压力(添加氯霉素)和无选择压力(未添加氯霉素)的条件下，测定pHT43/CB重组质粒在纳豆芽胞杆菌中的遗传稳定率[14]。将重组子分别接种于5 mL有选择性培养基(含25 μg/mL氯霉素的LB培养基)和无选择性培养基中，37 ℃、130 r/min培养12 h；每12 h传代1次，连续传代培养30代；利用重组质粒pHT43中含有氯霉素抗性的特征，每传代10次进行质粒稳定率测定；质粒稳定率等于从不含氯霉素抗性的平板上选取100个单菌落，点种于含氯霉素抗性的平板上，得出最后长出的菌落数的百分率。

1.2.6 转入pHT43/CB的纳豆芽胞杆菌的抑菌活性的测定 吸取0.1 mL金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的培养物(菌数为107cfu/mL)分别均匀涂布于LB固体平板上，自然干燥30 min，将牛津杯(内径为6 mm)均匀放置在平板上，确保其与平板培养基接触面无空隙，分别吸取0.2 mL 转入pHT43/CB的纳豆芽胞杆菌、转入pHT43的纳豆芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、干酪乳杆菌等益生菌发酵液于牛津杯中(菌数均为109cfu/mL)，37 ℃培养10～12 h，观测抑菌活性[15]。

针对本课题所研究得出的协同育人机制，将在厦门理工学院新丝路时尚学院学院进行试行实践，因为“实践是检验真理的唯一标准”，我们将在实践的检验中研究和探索出一套实际效果好、可操作性强且具有可推广性的一套协同育人机制。

1.2.7 含pHT43/CB的纳豆芽胞杆菌及野生菌株生长曲线的测定 为验证外源重组质粒对野生菌种的整体生长水平是否有影响，采用比浊法，将发酵液适度稀释，每隔2 h测定1次含pHT43/CB的纳豆芽胞杆菌及野生菌在630 nm处的OD值，绘制其生长曲线图[16]。

2 结果与分析

2.1 CB基因序列获取

扩增出CB片段如图1所示，在100 bp处出现条带，与预期大小相符，测序片段全长105 bp，将测序结果与NCBI上报道CB的cDNA全序列基因(基因登录号：NM_001043995.1)进行Blast比对分析，其中该目的基因的CDs区位于107～184 bp处，结果显示其同源性为97%(图2)，之后进行氨基酸序列比对，结果同源性为100%，即碱基的突变并未影响目的蛋白的改变。

图1 CB基因PCR产物电泳图谱Fig.1 PCR products of the CB gene

图2 CB基因核酸序列的比对Fig.2 Nucleic acid sequence alignent of the CB gene

2.2 纳豆芽胞杆菌中重组表达载体的构建和鉴定

重组质粒pHT43/CB，片段长为8 162 bp，见图3。将重组质粒转化到纳豆芽胞杆菌中，提取阳性克隆子，进行单双酶切鉴定，如图4，其中pHT43载体片段长度为8 057 bp。在105 bp处出现目的基因的条带，其大小符合预测值，证明重组表达载体的质粒已经成功转入纳豆芽胞杆菌中。

图3 重组载体的构建Fig.3 Construction of the recombinant plasmid

图4 重组载体酶切验证Fig.4 Identification results of the recombinant plasmid with endonuclease reactionM：DL2 000标准分子量；1：pHT43/CB重组载体；2：Xba I和Aat II双酶切；3：Xba I单酶切M：DL2 000 Marker；1：Recombinant plasmid；2：pHT43/CB digested with Xba I and Aat II；3：pHT43/CB digested with Xba I

2.3 Western-blot检测结果

为了验证重组载体在纳豆芽胞杆菌中是否高效表达，经过24 h的IPTG诱导后，提取菌体蛋白样，该目的蛋白大小为3.8 kD，之后进行Western-blot验证结果(见图5)，经诱导后的目的蛋白条带明显加粗，即目的蛋白表达量明显提高。

图5 Western-blot 检测纳豆芽胞杆菌中CB基因蛋白表达Fig.5 Western-blot analysis of the expression of CB in Bacillus natto1:重组菌株经IPTG诱导后的蛋白表达情况；2:重组菌未诱导的蛋白表达情况；3:标准品1:Protein expression of recombinant strains after induction with IPTG；2:Protein expression of recombinant strains before induction；3:Standard of CB

2.4 质粒稳定性测定结果

重组质粒pHT43/CB的稳定性，结果见图6。从图6A和B中对比可知，重组质粒分别在选择性培养基(添加氯霉素，Cm+)和无选择性培养基(无氯霉素，Cm-)传代培养30次的菌落数比值均为100%，说明重组质粒pHT43/CB的稳定性良好。

2.5 含有pHT43/CB重组菌的抑菌活性测定结果

实验测定重组菌的抑菌活性，结果见图7。图7a、b表示抑制大肠埃希菌的效率，发现干酪乳杆菌的抑菌活性优于重组菌，枯草芽胞杆菌和重组菌的抑菌活性均较低，但重组菌的抑菌活性优于野生菌的抑菌活性；图7c、d表示抑制金黄色葡萄球菌的效果，重组菌的抑菌活性明显高于干酪乳杆菌、枯草芽胞杆菌及其野生菌。

图6 重组子质粒稳定性检测Fig.6 Plasmid stability test of the recombinantsa、b、c：选择性培养基中第10、20、30代重组质粒pHT43/CB生长情况；d、e、f：无选择性培养基中第10、20、30代重组质粒pHT43/CB生长情况a，b，c：respectively represent the stability of recombinant bacteria of 10,20 and 30 passage in resistant (chloramphenicol was added) medium; d，e，f：respectively represent the stability of recombinant bacteria of 10,20 and 30 passage in non-resistant (no chloramphenicol) medium

图7 含有pHT43/CB的重组菌与其他乳酸菌抑菌活性的比较Fig.7 The comparison of the inhibitory activity between pHT43/CB Bacillus natto and other bacteriaa、b：以大肠埃希菌为指示菌；c、d：以金黄色葡萄球菌为指示菌；①干酪乳杆菌；②枯草芽胞杆菌；③：含pHT/CB的纳豆芽胞杆菌；④纳豆芽胞杆菌；⑤含pHT43的纳豆芽胞杆菌；⑥H2Oa，b：E. coli bacteria are indicative bacteria; c，d：Staphylococcus aureus indicative bacteria；①Lactobacillus casei; ②Bacillus subtilis;③Bacillus natto with pHT43/CB; ④Bacillus natto; ⑤ Bacillus natto with pHT43; ⑥H2O

2.6 含有pHT43/CB重组菌及野生菌生长曲线的测定结果

含有pHT43/CB重组菌及野生菌生长曲线的测定结果见图8，发现2种菌株在指数期之前基本无差异，但是重组菌的指数末期及稳定期稍高于野生菌株，可见，外源重组载体并不影响菌株的生长代谢，而且有可能促进菌体代谢。

图8 纳豆芽胞杆菌及重组菌生长曲线Fig.8 Curves of the growth of Bacillus natto and the recombinant

3 讨 论

迄今为止，人们已经利用微生物成功表达合成了多种天蚕素抗菌肽，例如单基因、融合基因以及杂合肽等。在抗生素耐药性日益严重，病毒病和肿瘤仍未攻克的今天，抗菌肽的出现无疑为人们寻找理想的抗菌、抗病毒和抗肿瘤药物提供新的研究方向[17]。纳豆芽胞杆菌作为表达外源基因的受体菌，其自身的表达系统并未被人们熟知，而且表达系统相对枯草芽胞杆菌尚不稳定，本研究将抗菌肽天蚕素B基因转入至原核生物纳豆芽胞杆菌中尚属首次报道。本研究发现，抗菌肽天蚕素B基因可以成功转入至原核细菌中。因纳豆芽胞杆菌同属于枯草芽胞杆菌的变种，因此本研究按照枯草芽胞杆菌感受态的制备方法处理纳豆芽胞杆菌，同时，pHT43属于枯草芽胞杆菌表达载体，也有利于转化进行。在本研究连续传代过程中，测定质粒的稳定性为100%，结果表明天蚕素B能够在纳豆芽胞杆菌中表达并稳定传代，本研究为纳豆芽胞杆菌转入外源基因提供了技术基础。

本研究抑制金黄色葡萄球菌的效果明显高于其野生菌及干酪乳杆菌和枯草芽胞杆菌，但抑制大肠埃希菌的效果不如干酪乳杆菌和枯草芽胞杆菌。因此，转天蚕素B的纳豆芽胞杆菌可用于金黄色葡萄球菌等革兰阳性菌的防治，还可以和干酪乳杆菌等配合共同防治大肠埃希菌等革兰阴性菌。本研究为开展抗菌肽天蚕素B基因在益生菌中的高效表达和应用提供了技术基础。

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Expression of the Antimicrobial Peptide Cecropin B gene in Bacillus natto

ZHANG Shuang1, LUO Chao-chao1, WU Cai-xia2, GAO Xue-jun1

(1.KeyLab.ofAgric.Bio-FunctionalGenes,NEAgric.Uni.,Harbin150030; 2.LifeSci.Res.Ctr.,HebeiNorthUni.,Zhangjiakou075000)

Antimicrobial peptides are a class of small molecule peptides possessing bio-activity appear through inductioninvivo. Cecropin B was first isolated and obtained from wild silkworm body, a thermo-stable soluble peptide, it has stronger resistance among numerous antimicrobial peptides isolated so far. In this experiment, aBacillussubtilisexpression vector pHT43 was used and then transfered the cecropin B gene intoB.nattoand verified the expression and stability in targeted bacteria as well as analysis of the antimicrobial activity, The results showed that cecropin B was expressed inBacillusnattoand could stably transfer to next generation, as well as could improve the antimicrobial activity ofB.natto, its antimicrobial activity againstStaphylococcusaureuswas better than that of bothLactobacilluscaseiandBacillussubtilis. This study provided technical basis for the application of the recombinant bacterium as feed additive. And this paper for the first time reports the expression of cecropin B inB.nattoand have important theoretical significance

cecropin B;Bacillusnatto; expression; generation transfering; antimicroorganism

国家“863”计划项目(2013AA102504-03)

张双 女，硕士研究生。研究方向为转基因微生物。E-mail: zhuimengzs@163.com

* 通讯作者。男，教授，博士生导师。研究方向为动物生物技术。E-mail: gaoxj5390@sina.com

2014-12-12；

2015-05-05

Q819

A

1005-7021(2016)01-0057-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.010