生物炭对香蕉苗根际土壤微生物群落与代谢活性的影响

李 航， 董 涛， 王明元,3*

(1.华侨大学 园艺系，福建 厦门 361021;2.广东省农业科学院 果树研究所，广东 广州 510640；3.华侨大学 园艺科学与工程研究所，福建 厦门 361021)



生物炭对香蕉苗根际土壤微生物群落与代谢活性的影响

李 航1， 董 涛2， 王明元1,3*

(1.华侨大学 园艺系，福建 厦门 361021;2.广东省农业科学院 果树研究所，广东 广州 510640；3.华侨大学 园艺科学与工程研究所，福建 厦门 361021)

采用盆栽培养香蕉小苗，以生物炭与土壤的不同比例混合作为培养基质。3个月后采集香蕉苗根际土壤，采用稀释平板菌落计数法测定微生物数量；采用BIOLOG-ECO技术分析香蕉苗根际土壤微生物群落。结果显示，生物炭的施加能够显著增加土壤中微生物数量，生物炭低量(C1)施加对真菌、放线菌的数量就有明显提高，最高分别达到12.1×103cfu/g、10.2×104cfu/g。较高生物炭的施加量(C2、C3)显著提高细菌、氨化细菌和固氮菌数量，最高分别达到8.8×106cfu/g、4.5×103cfu/g、17.0×105cfu/g。BIOLOG-ECO分析表明，生物炭的施加提高了微生物群落平均颜色变化率(Average well color development，AWCD)，多样性指数和碳源利用丰度。生物炭的施加提高了香蕉苗根际微生物对碳源的利用能力。在同一时期，微生物对不同碳源的利用能力均表现为C3处理组最高，CK较低。结果表明，生物炭的添加对提高香蕉苗根际土壤微生物群落数量，改善微生物群落构成和代谢具有显著作用。

生物炭；香蕉苗；微生物；群落；BIOLOG-ECO

在热带、亚热带地区香蕉作为一种主要的经济水果被广泛种植，被称为“智慧之果”、“世界上第一种快餐食物”等美誉。香蕉的传统栽培施用大量的化肥，导致香蕉园出现土壤结构破坏，土壤板结，有机质含量下降，微生物群落活力低等问题[1]。生物炭是指在无氧条件下，将生物质热解转化而成富含碳元素的固体物质[2]。田间施用生物炭能明显增加土壤有机质[3]、无机质营养、阳离子交换量，调节土壤pH，增强土壤持水能力，进而改善土壤环境[4]。此外，生物炭的多孔隙结构为土壤中的微生物提供了有利的生长繁殖环境，促进植物根系周围微生物群落的发育，根际微生物群落的呼吸作用与营养代谢，促进了植物的生长。Demisie等[5]发现橡树以及竹子所制生物炭可提高土壤中有机碳含量、土壤聚合性、微生物活性及炭在土壤中的存留时间，明显改善红土的土壤质量。王晓辉等[6]研究表明生物炭的添加显著提高了油菜栽培土壤pH，表明生物炭具有减缓土壤酸化水平的能力。Rutigliano等[7]在小麦土地中添加生物炭，发现在最初3个月中，土壤微生物底物诱导呼吸作用和一些酶的比活力有明显提升。谷思玉等[8]通过盆栽实验研究不同量生物炭对大豆根际土壤微生物影响，发现添加生物炭可明显提高酸性土壤pH值和微生物数量，土壤中的有机碳、有效磷、速效钾等也显著提高。近年来，生物炭作用于植物及土壤微生物的研究日趋增多，已经成为生物炭领域的研究热点，但生物炭对香蕉幼苗及根际土壤微生物群落的影响鲜见报道。目前，对于土壤微生物群落的研究方法有很多，如脂肪酸分析、FISH、TGGE、DGGE等方法，但都无法体现微生物群落的总体活性和代谢功能信息[9]。生物炭对土壤的研究目前还主要集中于对土壤微生物与土壤酶的传统研究，对土壤微生物群落功能的研究还不够。而BIOLOG技术经过多年的发展已经越来越成熟，在对不同管理的农业土壤、草地、森林土壤、植物根际和堆肥环境下都可以有效地描述微生物群落的代谢功能多样性[10]。本研究通过微生物量计数测定以及BIOLOG技术对土壤微生物进行研究，以讨论生物炭的添加对香蕉苗根际微生物的影响，以期为生物炭在香蕉园的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土壤 取自华侨大学厦门校区，将土壤中的枯枝、根系、土壤动物、大石块等杂物挑除后，晾干备用。

1.1.2 供试作物 香蕉(Musaparadisiaca)：中蕉3号幼苗，由广东省农业科学院果树研究所提供。

1.1.3 供试生物炭 由香蕉假茎经过高温厌氧制备，由广东省农业科学院果树研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 实验设计 利用盆栽实验，设计4个实验组：不施加生物炭组(CK)，生物炭施加(生物炭施加量重量百分比)组1%(C1)、2%(C2)、3%(C3)，共4个处理，每个处理重复5盆，每盆装入土壤或生物炭土壤混合基质共5 kg，共20盆。2014年4月12日，选取长势一致的中蕉3号香蕉苗定植盆中，每盆1棵。放置在华侨大学园艺系温室培养，常规管理。

1.2.3 数据统计分析 通过平均颜色变化率(Average well color development，AWCD)、物种丰度指数(H)、均匀度指数(E)和碳源利用丰度指数(S)对BIOLOG-ECO板进行数据分析[16-17]：①平均颜色变化率计算方法(采用168 h数据，下同)：AWCD = Σ(C-R)/n。其中，C为每个平板小孔在590 nm和750 nm两波段处的光密度差值，若差值为负值或小于0.06则以0计算；R表示对照孔的光密度值；n为培养基碳源种类数(在ECO板中n为31)。②物种丰度指数计算方法：H=-ΣP(lnP)。其中P为每个孔的相对吸光度与整个平板相对吸光度之和间的比值：P=(C-R)/Σ(C-R)。③均匀度指数计算方法：E=H/lnS。④碳源利用丰度指数S：为利用碳源数量总和。实验数据使用Microsoft Excel 2003，Origin(V8)进行处理，主成分分析采用IBM SPSS Statistics 19统计分析。

2 结果与分析

2.1 施加生物炭对香蕉苗根际土壤微生物数量的影响

2.1.1 施加生物炭对细菌、真菌和放线菌数量的影响 由图1A可知，香蕉苗土壤施加生物炭培养3个月后， C1、C2、C3处理中细菌数量相较于CK均有明显升高，呈现CK

图1 生物炭对香蕉苗根际土壤细菌、真菌、放线菌数量的影响Fig.1 Effects of biochar on bacteria, fungus and actinomycetes in rhizospheric soil of banana seedlings

2.1.2 施加生物炭对放线菌、固氮菌数量的影响 图2A为在各处理组中香蕉苗根际土壤中固氮菌数量的情况，表现为CK

图2 生物炭对香蕉苗根际土壤固氮菌、氨化细菌数量的影响Fig.2 Effects of biochar on azotobacter and ammonifying bacteria in rhizospheric soil of banana seedlings

2.2 香蕉苗根际土壤微生物群落代谢情况

2.2.1 施加生物炭对微生物群落AWCD的影响 如图3所示，不同生物炭处理组的AWCD随着时间呈现上升趋势，各曲线均有一段延缓期，可能是由于培养温度较低，微生物群落活性也较低，需要经过一段时间的培养才能达到较高的活性。CK组的拐点出现在72 h，C1组在48 h，C2、C3组在36 h。在168 h内，AWCD的最大值与变化速率均呈现C3>C2>C1>CK。这说明了生物炭的添加明显提高了香蕉苗根际土壤中微生物利用碳源的能力，从而提高了微生物群落的活性，并且随着添加碳源量的增加而增加。

图3 不同生物炭处理对微生物群落AWCD的影响变化Fig.3 Effects of biochar on microbial communities AWCD

2.2.2 施加生物炭对香蕉苗根际土壤微生物群落多样性的影响 从表 1可以看出，生物炭处理组中微生物群落多样性指数与均匀度指数均明显高于CK组，表明根际土壤中的微生物复杂性、功能多样性随着生物炭施加量的增加而增加。同时，生物炭处理组也与CK组的均匀度指数呈显著差异，表明生物炭在改善微生物种群均匀度方面也有明显作用。生物炭施加组碳源利用丰度高于CK组，但组间差异不明显，说明生物炭的施加未能改变微生物群落利用底物碳源的数量。从168 h时的AWCD比较可看出，生物炭的添加明显提高了AWCD值，并且随着生物炭添加量的增加，对应AWCD值增加的效果也越明显。

2.2.3 施加生物炭对土壤微生物群落碳源利用能力的影响 图4为不同生物炭处理后，香蕉苗根际土壤中微生物连续168 h对六大类碳源的利用情况。由图4可看出，培养72 h后各组间利用碳源的情况出现差异，并在168 h各处理组达到最大值。其中复合物、糖类、羧酸类、氨基酸类具有较高AWCD值，说明它们是微生物群落利用的主要碳源，而胺类和酚类化合物明显利用较少。糖类、氨基酸类和胺类均呈现C3>C2>C1>CK的趋势，而复合物与羧酸类碳源为C3>C1>C2>CK，酚类碳源为C3>C2>CK>C1。复合物和胺类在168 h培养时间内各处理组间未出现显著差异。糖类和羧酸类分别在120 h和96 h开始生物炭处理组AWCD值显著高于CK组，但处理组间未有显著差异。氨基酸48 h开始生物炭处理组就与CK组产生显著差异，并在之后的培养中高浓度生物炭处理组(C2、C3)显著高于低浓度处理组(C1)。酚类碳源的AWCD值在48 h后高浓度生物炭处理组(C2、C3)显著高于空白组(CK)与低浓度生物炭处理组(C1)。表明生物炭的施加可以促进香蕉苗根际微生物群落对主要碳源的利用。同时较高浓度的生物炭施加还能提高根际微生物对胺类、酚类碳源的利用能力。

表1 不同生物炭施加量对土壤微生物群落多样性指数和168 h AWCD的影响

注：不同小写字母表示差异显著(下同)

图4 不同生物炭量施加对土壤微生物碳源底物AWCD的影响Fig.4 Effects of biochar on AWCD of carbon substrate by soil microbial community

通过主成分分析，可以利用降维思想，从大量的数据中揭示出存在于微生物群落之间的功能差异性，在主成分分析后可以用点在降维后的主元向量空间中的位置来反映不同的微生物群落功能性关系的远近。图5为不同生物炭处理组香蕉苗根际土壤微生物群落多样性的主成分分析图。从图5中可以看出，主成分PC1的贡献率为58.46%，主成分PC2贡献率为25.34%，PC1远大于PC2， PC1更能反映出不同处理组间的差异，因此可以根据PC1对微生物群落功能性进行分析。观测各处理组点的分布，可发现CK组处于PC1负端方向，C1组接近零点，而C2、C3生物炭处理组则集中在PC1的正向方向，生物炭处理组与CK组表现出明显的分布差异。这表明CK组与生物炭处理组在生物群落功能性方面具有明显差异，生物炭对于增强土壤中微生物群落功能性具有显著的作用。同时，不同量生物炭处理组点并没有十分集中，表明生物炭的添加不同程度地影响了微生物群落的功能性。

图5 不同生物炭施加量对根际土壤微生物群落代谢特性的主成分分析Fig.5 Principal component analysis in metabolic characteristic of rhizospheric soil microbial community under different biochar treatments

3 讨 论

土壤中施加生物炭可以显著增加微生物数量，这与生物炭的自身特性有密切关系[18-19]。生物炭对微生物生长的促进可能源于以下几个方面[20]：生物炭均有丰富的孔隙结构，添加到土壤中后，明显优化了土壤的保肥能力和通氧量进而促进了微生物的生长。另外，生物炭大的比表面积与大量孔径结构为微生物提供了良好的附着点和理想的生长场所。生物炭高温制备过程中同时也形成很多新的碳源类型，增加了土壤中的微生物种类。

研究发现，施加生物炭不同程度地促进了土壤中细菌、真菌、放线菌、固氮细菌和氨化细菌的生长。Doan等[21]发现，在施肥土壤中配合施加生物炭，土壤中的细菌数较未施加生物炭有明显提高。可能是由于生物炭的多孔、疏松特性，为土壤中细菌提供了更多的生长空间，从而提高了细菌的数量。大量的细菌代谢活动和生物炭带入的大量营养元素也改善了土壤肥力情况。生物炭的施加明显提高氨化细菌的数量，而氨化细菌在将土壤中的有机氮转化为氨态氮的初始阶段起着关键作用[22]，故氨化细菌增加了土壤中植物可以直接吸收的无机氮含量，间接促进植物生物量的增加。

Garland等[16]在1991年首先利用BIOLOG微孔板对微生物菌落特征进行描述，随后BIOLOG微孔板在微生物群落功能研究领域的应用越来越多[23]。AWCD能够反映出不同微生物群落对碳源利用的总能力和功能的多样性，故AWCD是反映微生物群落代谢的重要指标[24-25]。研究表明，AWCD值越高，土壤微生物群落的代谢功能越强[26]。本研究发现，施加生物炭的土壤微生物群落AWCD在各时期均高于CK，并且，同一时期微生物群落AWCD值随生物炭量的增加而升高。不同处理组的AWCD拐点的出现时间为C3、C2 36 h,C1 48 h,CK 72 h，原因可能是生物炭的施加导致微生物数量的不同，并且生物炭的添加促进了香蕉苗根际土壤微生物群落的代谢能力。

微生物群落多样性指数反映微生物群落中种群的多样性，一个生态系统微生物多样性指数越高，表明微生物的种类越多、越复杂。同时反映该微生物群落的功能多样性越高，反之则越低。微生物群落的碳源利用丰富度与均匀度反映了微生物群落对不同单一碳源利用的能力和种类中个体分布的均匀性。生物炭的施加使微生物群落同时在物种丰度指数、均匀度指数上与CK组间均出现了明显差异，这都表明生物炭的施加促进了土壤微生物的生长，对微生物群落的代谢功能起到了促进作用。BIOLOG-ECO 96微孔板中共有31种六大类碳源(第32为对照组：水)：复合物类、糖类、羧酸类、氨基酸类、胺类和酚类化合物[27]。微生物群落对于每种碳源的利用差异，可以通过底物碳源反应后与显色剂显色的变化程度来体现。目前，利用BIOLOG-ECO技术研究生物炭对微生物群落的影响还鲜有报道，有研究者利用不同的方法、材料发现了生物炭对于微生物群落的促进作用。Farrel等[28]通过磷酸脂肪酸分析(PLFAs)和复合同位素分析(CSIA)的方法，研究土壤微生物对生物炭中碳源的利用，研究发现，部分生物炭中的碳元素能够被微生物利用于呼吸作用及磷酸酯的形成代谢中，从而促进微生物群落的生长。吕伟波[29]测定分析土壤中微生物量，发现生物炭能够提高微生物量，且提高程度随着浓度的增加而递增。Muhammad等[30]也发现不同的生物炭及施加量均能明显提高细菌、放线菌、革兰阴性菌、硫酸还原菌的磷酸脂肪酸含量。但是他们的研究只能揭示生物炭的添加与微生物群落数量及分子信息方面的关系，无法解读生物炭对于整个微生物群落代谢能力、活性的影响。而BIOLOG技术详细地反映了这方面的信息。顾美英等[31]通过BIOLOG技术发现生物炭的施用对灰漠土与风沙土连作棉田的根际、非根际土壤微生物群落的功能多样性有显著影响。特别是提高了羧酸类微生物的活性。张千丰[20]通过向白浆土中施加生物炭，发现生物炭可有效提高土壤中微生物群落多样性指数、碳源利用数和均匀度指数。本研究发现了相似结论：生物炭的施加可显著提高香蕉苗根际土壤微生物群落的物种丰度、均匀度，但碳源利用丰度未出现显著差异。另外，我们发现生物炭的施加促进了香蕉苗根际微生物群落对糖类、羧酸类和氨基酸类碳源的利用能力。较高浓度的生物炭施加对微生物群落利用酚类、胺类碳源的能力有促进作用。总的来说，生物炭的施加对香蕉苗根际微生物群落具有积极的促进作用。

[1] 陈明智,吴蔚东,李雯,等.多年连栽香蕉园土壤养分与酶活性变化[J].生态环境,2008,17(3):1221-1226.

[2] Fang Y,Singh B,Singh BP.Effect of temperature on biochar priming effects and its stability in soils[J]. Soil Biology &Biochemistry, 2015, 80(80):136-145.

[3] 刘玉学,刘微,吴伟祥,等.土壤生物质炭环境行为与环境效应[J]. 应用生态学报，2009,20(4):977-982.

[4] 袁金华,徐仁扣.生物质炭的性质及其对土壤环境功能影响的研究进展[J]. 生态环境学报,2011,20(4):779-785.

[5] Demisie W，Liu Z，Zhang M. Effect of biochar on carbon fractions and enzyme activity of red soil[J].Catena,2014,121(5):214-221.

[6] 王晓辉,郭光霞,郑瑞伦,等. 生物炭对设施退化土壤氮相关功能微生物群落丰度的影响[J].土壤学报,2013,50(3):624-631.

[7] Rutigliano F A,Romano M,Marzaioli R,et al.Effect of biochar addition on soil microbial community in a wheat crop[J].European Journal of Soil Biology，2014，60(2): 9-15.

[8] 谷思玉,李欣洁,魏丹,等.生物炭对大豆根际土壤养分含量及微生物数量的影响[J].大豆科学,2014,(3):393-397.

[9] 席劲瑛,胡洪营,钱易.Biolog方法在环境微生物群落研究中的应用[J]. 微生物学报,2003,43(1):138-141.

[10]Cederlund H,Thierfelder T,Stenstrom J.Functional microbial diversity of the railway track bed[J].Science of the Total Environment,2008,397(1-3):205-214.

[11]韩光明. 生物炭对不同类型土壤理化性质和微生物多样性的影响[D].沈阳: 沈阳农业大学，2013.

[12]邢肖毅，黄懿梅，安韶山，等. 黄土丘陵区不同植被土壤氮素转化微生物生理群特征及差异[J]. 生态学报，2013，33(18): 5608-5614.

[14]Wang G H，Liu J J，Qi X N，et al. Effects of fertilization on bacterial community structure and function in a black soil of Dehui region estimated by Biolog and PCR-DGGE methods[J]. Acta Ecologica Sinica，2008，28(1): 220-226.

[15]Jiang Z，Li P，Wang Y H，et al. Effects of roxarsone on the functional diversity of soil microbial community[J]. International Biodeterioration & Biodegradation， 2013， 76(1): 32-35.

[16]Garland J L，Mills A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization[J]. Applied and Environmental Microbiology，1991，57(8): 2351-2359.

[17]郑丽萍，龙涛，林玉锁，等. Biolog-ECO解析有机氯农药污染场地土壤微生物群落功能多样性特征[J]. 应用与环境生物学报，2013，(5): 759-765.

[18]Ducey T F，Ippolito J A，Cantrell K B，et al. Addition of activated switchgrass biochar to an aridic subsoil increases microbial nitrogen cycling gene abundances[J]. Applied Soil Ecology，2013，65(2): 65-72.

[19]Warnock D D，Lehmann J，Kuyper TW，et al. Mycorrhizal responses to biochar in soil-concepts and mechanisms[J]. Plant and Soil，2007，300(1-2): 9-20.

[20]张千丰. 作物残体生物炭基本特征及对白浆土、黑土改良效果的研究[D].北京: 中国科学院研究生院，2013.

[21]Doan T T，Bouvier C，Bettarel Y，et al. Influence of buffalo manure, compost, vermicompost and biochar amendments on bacterial and viral communities in soil and adjacent aquatic systems[J]. Applied Soil Ecology，2014，73(2): 78-86.

[22]袁耀彬. 桉树根际土壤功能菌多样性与抗青枯病的关系研究[D].桂林: 广西师范大学，2012.

[23]郑华，欧阳志云，方治国，等. BIOLOG在土壤微生物群落功能多样性研究中的应用[J]. 土壤学报，2004，41(3): 456-461.

[24]Liu B，Li Y，Zhang X，et al. Combined effects of chlortetracycline and dissolved organic matter extracted from pig manure on the functional diversity of soil microbial community[J]. Soil Biology and Biochemistry，2014，74: 148-155.

[25]周登博，井涛，谭昕，等. 施用拮抗菌饼肥发酵液和土壤消毒剂对香蕉枯萎病病区土壤细菌群落的影响[J]. 微生物学报，2013，53(8): 842-851.

[26]Zhang H，Li G，Song X，et al. Changes in soil microbial functional diversity under different vegetation restoration patterns for Hulunbeier Sandy Land[J]. Acta Ecologica Sinica，2013，33(1): 38-44.

[27]Choi K H，Dobbs F C. Comparison of two kinds of Biolog microplates (GN and ECO) in their ability to distinguish among aquatic microbial communities[J]. J Microbiol Methods，1999，36(3): 203-213.

[28]Farrell M，Kuhn T K，Macdonald L M，et al.Microbial utilisation of biochar-derived carbon[J]. Science of the Total Environment，2013，465: 288-297.

[29]吕伟波. 生物炭对土壤微生物生态特征的影响[D]. 杭州: 浙江大学，2012.

[30]Muhammad N，Dai Z，Xiao K，et al. Changes in microbial community structure due to biochars generated from different feedstocks and their relationships with soil chemical properties[J]. Geoderma，2014，226-227(8): 270-278.

[31]顾美英，徐万里，唐光木，等. 生物炭对灰漠土和风沙土土壤微生物多样性及与氮素相关微生物功能的影响[J]. 新疆农业科学，2014，51(5):926-934.

Effects of Biochar on Microbial Communities and Metabolic Activity in Rhizospheric Soil of Banana Seedlings

LI Hang1, DONG Tao2, WANG Ming-yuan1,3

(1.Dept.ofHorticul., 2.Inst.ofPomology,GuangdongAcad.ofAgric.Sci.,Guangzhou510640；3.Inst.ofHorticul.Sci. &Engin.,HuaqiaoUni.,Xiamen361021)

Potting of banana seedlings was adopted with mixture of biochip and soil in different proportions as cultivation substrata. Rhizospheric soil of banana seedlings was collected three months after the cultivation. The amount of microbes was determined and tested adopting attenuation plat colonies counting and BIOLOG-ECO technique to analyze the rhizospheric microbial communities of banana seedlings. The results showed that the application of biochar significantly increased the quantities of microbes. Low application of biochar (C1) significantly increased the quantity of fungi and actinomycetes at the highest of 12.1×103cfu/g, 10.2×104cfu/g respectively. biochar amendment (C1), while bacteria, ammonifying bacteria and azotobacter were at the high at 8.8×106cfu/g, 4.5×103cfu/g, 17.0×105cfu/g as compared with higher biochar application (C2 and C3). BIOLOG-ECO analysis suggested that the application of biochar improved average well color development (AWCD) of microbial communities, diversity index of Shannon index (H) and carbon source utilization abundance of Evenness index (E). The biochar application improved the capability of rhizospheric microbial communities’ utilization rates of carbon source rate. In addition, the microbial communities’ utilization rates of carbon source in C3 treatment was the highest, and CK was fairly low in the same periods. Finally it was concluded that the addition of biochar had significant effects to improve the quantities of rhizospheric microbial communities and metabolism in banana seedlings.

biochar; banana seedlings; microbe; communities; BIOLOG-ECO

农业部“948”计划项目子课题(2011-G16)；广东省农业科技攻关项目(2012A020602023)；广东省产学研项目(2012B091000159)

李航 男，硕士研究生。主要从事微生物生理生态研究。E-mail:lihang20093868@163.com

* 通讯作者。男，副教授，博士，硕士生导师。研究方向为园艺植物生理生态。Tel: 0592-6162300, E-mail:mywang@hqu.edu.cn

2015-05-20；

2015-07-06

Q939.96

A

1005-7021(2016)01-0042-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.008