刺槐根瘤菌与纤维素分解菌对上海青和高粱的促生效应

邓振山， 杜 洋, 贺晓龙, 赵瑞华

(延安大学 生命科学学院，陕西 延安 716000)



刺槐根瘤菌与纤维素分解菌对上海青和高粱的促生效应

邓振山， 杜 洋, 贺晓龙, 赵瑞华

(延安大学 生命科学学院，陕西 延安 716000)

通过盆栽试验，用刺槐根瘤菌(RhizobiumofRobiniapseudoacacia)与纤维素分解菌(Cellulose-decomposing Bacteria)对高粱和上海青进行单独接种和混合接种，采用针刺、浸种和涂叶3种接种方法，测量其各种生长指标。初步探究刺槐根瘤菌与纤维素分解菌联合对禾本科作物高粱和双子叶作物上海青两种非豆科植物的促生效应。结果表明，在非针刺条件下，两种菌混接组(B组)比单独接种根瘤菌组(D组)的促生效应更显著，上海青B组在灭菌条件下的根长促生率比D组高出48.97%，高粱B组在非灭菌条件下干重的促生率比D组高出30.76%；而且除了高粱的B组干重以外，盆栽试验条件下，B、D两组的其他生长指标在灭菌情况下的促生率比非灭菌条件下的促生率高，差别最大的为上海青B组鲜重，灭菌条件下比非灭菌条件下高出47.13%。根瘤菌与纤维素分解菌混合接种非针刺组，对高粱和上海青的各项生长指标促生效应明显，可为今后进一步开发非豆科作物菌肥提供试验依据。

刺槐根瘤菌；纤维素分解菌；混合接种；促生效应

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物材料 单子叶植物高粱(Sorghumvulgare)、双子叶十字花科植物上海青(BrassicachinensisL.)种子购自延安市某种子站。

1.1.2 盆栽实验土壤来源及处理 盆栽实验的土壤取自延安大学后山，去除表层2 cm部分，采用5点采样法在2～10 cm之间取样；将土样采集后用孔径为5 mm的筛子筛选，处理后的土壤与细沙按照土∶沙(质量比)=2∶1的比例混合均匀后装入上口直径15 cm，下底直径9 cm，高11.8 cm的塑料花盆中备用，每盆约装土1.5 kg[17]。

1.1.3 供试培养基及营养液 ①YMA培养基：甘露醇10 g，酵母粉1.0 g，硫酸钠0.2 g，氯化钙0.1 g，磷酸氢二钾0.5 g，根瘤微量元素液(硼酸5 g，钼酸钠5 g，蒸馏水1 000 mL)4 mL，氯化钠0.1 g ，蒸馏水1 000 mL，琼脂粉18～20 g，pH 7.0；②牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂15～20 g，水1 000 mL，pH 7.2；③刚果红鉴别培养基：羧甲基纤维素钠10 g，硫酸镁0.25 g，磷酸氢二钾0.5 g，氯化钠0.25 g，琼脂11 g，蒸馏水500 mL，加入刚果红指示剂；④PDA培养基：马铃薯100 g，蔗糖10 g，琼脂8.5 g，蒸馏水500 mL；⑤无氮营养液：蒸馏水1 000 mL，磷酸二氢钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，氯化钠0.2 g，硫酸钙0.1 g，碳酸钙5.0 g，pH 7.0～7.5。

1.1.4 供试菌株 根瘤菌Rhizobiumleguminosarum，分离自刺槐根瘤，纤维素分解菌Bacillussubtilis，均由延安大学微生物实验室鉴定和保藏。

1.2 方法

1.2.1 灭菌沙土盆栽法 ①接种物的准备：取保藏于YMA斜面的根瘤菌菌苔1环，接种到装有100 mL液体YMA培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min摇床培养48 h后，用 PBS 缓冲液(氯化钠8 g,氯化钾0.2 g,磷酸氢二钠1.44 g,磷酸二氢钾0.24 g, pH 7.4)稀释至约2.0×108cfu/mL，备用[11]。将纤维素分解菌点种到刚果红培养基上培养，菌落周围出现透明圈，将水解圈大的菌株蛇形划线到PDA斜面培养基上。取经活化的纤维素分解菌1环接种到装有100 mL液体PDA培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min摇床培养48 h后，用 PBS 缓冲液稀释至约2.0×108cfu/mL，备用[18]。②种子的处理：挑选饱满的种子用蒸馏水洗净，先用75%的酒精将种子浸泡5 min，然后用3%的次氯酸钠浸泡3 min，再用无菌水清洗8次。培养皿及滤纸高压灭菌处理，每个培养皿中放入5粒种子，并加入2 mL灭菌水于滤纸中，置于28 ℃恒温箱中催芽。③无菌沙土盆的准备：将装有土壤的沙土盆放入高压蒸汽灭菌锅121 ℃灭菌，每次1 h，重复灭菌3次。④接种[19]：将已催芽的种子按表1方式分为A、B、C、D和E五组。各组接种分别采用以下不同方法：a.针刺接种：用无菌解剖针在种子催出的芽上穿刺造成伤口，用无菌药棉蘸取菌悬液和无菌水分别敷于伤口处，接种后保湿5 d；b.浸种接种：用无菌水浸泡种子24 h后，将种子放入菌悬液中浸泡12 h，用清水洗净种子表面的细菌；c.涂叶接种：待植株生长5、25、45 d后，用无菌药棉醮取菌株培养液和无菌水分别涂抹株苗叶片接种，每次接种菌悬液5 mL，接种后保湿5 d。用以上方法接种时，如果为两种菌混接，均先接种纤维素分解菌再接种根瘤菌，且间隔2 h。E组为空白对照。⑤播种[17]：将灭菌的沙土盆按表1编号，并一一对应将上述接过菌的种子播入无菌沙土盆中，每盆5粒种子，深度约为1.5 cm，并覆土。每个处理设3个重复，自然光下培养并以无氮营养液保持其水分充足。⑥测量：苗出齐后，每盆定苗3株。60 d后取样，分别测量植株的生长指标，如株高、根长、鲜重、干重和叶片的叶绿素含量(SPAD)值，并计算出A、B、C、D各组生长指标相对于空白对照E组的促生率。

促生率(%)=

表1 灭菌沙土盆栽实验的处理设置

注： “+”表示采用此种方法接种；“-”表示不采用此种方法接种

1.2.2 非灭菌沙土盆栽法 除不做灭菌处理，其他操作方法均与无菌沙土盆栽法相同。

1.2.3 数据处理 实验数据采用Microsoft Excel 2010软件和IBM SPSS Statistics v19.0软件。

2 结果与分析

2.1 灭菌沙土盆栽条件下接种根瘤菌与纤维素分解菌对高粱和上海青的促生效应

通过灭菌沙土盆栽高粱和上海青并接种根瘤菌和纤维素分解菌测得对植物幼苗促生结果见表2。

表2结果表明，在灭菌沙土盆栽条件下，植物培养60 d后， B组实验即根瘤菌与纤维素分解菌混接且不采用针刺接种时，对高粱和上海青的促生效应均明显优于其他实验组的促生效应。两种菌混合接种且不采用针刺接种时，在株高、鲜重、干重、根长和SPAD值与对照组比较对上海青的促生效应分别增加了42.03%、111.11%、85.45%、56.86%和9.05%；对高梁的促生效应分别增加了18.9%、52.24%、53.41%、11.1%和5.48%。D组实验即只接种根瘤菌且不进行针刺接种的促生效应次之，只接种根瘤菌且不进行针刺接种时，在株高、鲜重、干重、根长和SPAD值与对照组比较对上海青的促生效应分别增加了19.19%、69.64%、56.36%、7.89%和6.36%；对高粱的促生效应分别增加了2.89%、25.26%、37.82%、4.84%和2.77%。A、C两组实验对这两种植物均无促生效应，甚至有抑制效果。

2.2 非灭菌沙土盆栽条件下接种根瘤菌与纤维素分解菌对高粱和上海青的促生效应

通过非灭菌沙土盆栽高粱和上海青并接种刺槐根瘤菌和纤维素分解菌测得对植物幼苗促生结果见表3。

表2 灭菌沙土盆栽条件下刺槐根瘤菌与纤维素分解菌对非豆科植物生长的影响

注: 植株在 60 d 测量, 表中数据表示平均值±标准偏差, 不同字母表示不同的显著性差异(P<0.05)，下表同

表3 非灭菌沙土盆栽条件下刺槐根瘤菌与纤维素分解菌对非豆科植物生长的影响

表3结果表明，在非灭菌沙土盆栽条件下，植物培养60 d后，B组实验即根瘤菌与纤维素分解菌混接但不采用针刺接种时，对高粱和上海青的促生效应均优于其他实验组的促生效应。两种菌混合接种且不采用针刺接种时，在株高、鲜重、干重、根长和SPAD值与对照组比较对上海青的促生效应分别增加了39.93%、63.98%、51.85%、41.72%和5.45%，对高梁的促生效应分别增加了16.22%、48.71%、55.38%、9.84%和4.46%。D组实验即只接种根瘤菌且不进行针刺接种的促生效果次之，而且B组和D组植物各项生长指标差异变大。只接种根瘤菌且不进行针刺接种时，在株高、鲜重、干重、根长和SPAD值与对照组比较对上海青的促生效应只增加了18.97%、27.96%、16.67%、7.53%和2.72%，对高梁的促生效应分别增加了2.59%、 20.87%、24.62%、3.85%和1.85%。A、C两组对上海青的各项指标均有抑制作用，A、C两组对高粱的株高、根长和SPAD有抑制作用。

2.3 上海青灭菌、非灭菌盆栽实验各项生长指标的促生率对比

将上海青灭菌盆栽实验与非灭菌盆栽实验中B组和D组的各项生长指标与E组相比较得出的促生率见图1。图1表明，上海青B组和D组在灭菌盆栽实验条件下的促生率均高于非灭菌盆栽实验条件下的促生率。B组灭菌盆栽实验株高、鲜重、干重、根长和SPAD值的促生率相比非灭菌盆栽实验分别高出2.1%、47.13%、33.6%、15.14%和3.6%；D组灭菌盆栽实验比非灭菌盆栽实验分别高出0.22%、41.68%、39.69%、0.36%和3.64%。

图1 上海青盆栽实验促生率Fig.1 The growth index growth rate of Brassicachinensis L. under the condition of pot experimentand

2.4 高粱灭菌、非灭菌盆栽实验各项生长指标的促生率对比

将高粱灭菌盆栽实验与非灭菌盆栽实验中B组和D组的各项生长指标与E组相比较得出的促生率见图2。

图2 高粱盆栽实验促生率Fig.2 The growth index growth rate of Sorghum vulgare under the condition of pot experimentand

图2表明，高粱除了B组干重以外，B组和D组在灭菌盆栽实验条件下其他生长指标的促生率比非灭菌盆栽实验条件下的高，但差距不大。B组灭菌盆栽实验株高、鲜重、根长和SPAD值的促生率相比非灭菌盆栽实验分别高出2.68%、3.53%、1.26%和1.02%；D组灭菌盆栽实验比非灭菌盆栽实验分别高出0.3%、4.39%、13.2%、0.99%和0.92%。

3 讨 论

本研究采用灭菌沙土盆栽和非灭菌沙土盆栽两种不同栽培方法，各具不同的条件，灭菌沙土盆栽实验可以达到去除微生物的理想效果，最大程度排除了其他微生物的干扰，而非灭菌沙土盆栽外部条件比较复杂。这些不同的外部条件在不同程度上影响了根瘤菌对各种植物生长的作用，从而使同一组实验在不同的生长条件下所测的生长指标也不相同。

实验结果表明，无论是灭菌沙土盆栽还是非灭菌沙土盆栽实验条件，两种菌混接且都不进行针刺接种(B组实验)对两种不同的非豆科植物在各项指标上均表现出很显著的促生作用，这是因为根瘤菌可以作为植物内生菌侵入非豆科植物根部并定殖，从而促进非豆科植物的生长[20]。Al-Mallah等[8]直接采用植物细胞壁降解酶先降解欧洲油菜的细胞壁，再接种根瘤菌的方法，结果显示根瘤菌不仅定殖在油菜细胞内而且还促进了油菜生长，本研究中B组实验采用的纤维素分解菌产生的纤维素酶可能水解植物部分细胞壁，促使根瘤菌更容易侵入非豆科植物根系，并起到促进非豆科植物生长的作用，此结果与Al-Mallah等的一致。作为内生菌，根瘤菌的促生作用表现在多个方面，比如可以提高非豆科植物对氮、磷等元素的吸收率、提高光合速率和植物根部的呼吸强度，产生吲哚乙酸和赤霉素等调节生长的植物激素以及增强植物抗逆能力和对病原菌的生物控制等[21]。在实验结果中，也可以看到B组实验在株高、鲜重、SPAD值等各方面的促生效应都比其他组实验更为显著。虽然只接种根瘤菌但不进行针刺接种(D组实验)的促生效果明显不如B组，但是也有一定的应用价值。因为根瘤菌作为非豆科植物PGPR的一个重要种类，可以在非豆科植物比如水稻、油菜等的根际定殖，并对非豆科植物根系以及地上部分的生长有很好的促进作用，这与王平等[10]、张晓霞等[11]和马天瑞等[12]的研究结果一致。

两种菌混合接种且都进行针刺接种(A组)和只接种根瘤菌且针刺接种(C组)相比对照组而言出现抑制作用，可能是因为针刺接菌时对植物根系造成伤害，尤其是在非灭菌沙土盆栽实验条件下更易导致病原微生物快速入侵，且病原菌一般生长速度快，短期内就成为优势菌，其通过获取植物营养大量生长，同时还会释放毒素及堵塞植物维管束等，导致植物体生长期间植株矮小、茎细、叶片发黄等。

实验表明，每种植物B组和D组灭菌沙土盆栽实验条件下的促生率比非灭菌条件下的促生率高，分析原因有三点：① 非灭菌沙土中含病原微生物数量多，从而影响植物生长，且多种微生物与根瘤菌有拮抗作用，由此影响根瘤菌生长[22];②灭菌沙土盆栽实验中高温高压处理土壤时蒸汽杀死土壤中大量生物，死亡的生物细胞快速释放出有机质进入土壤，从而使得土壤中可溶性有机质含量增加，这与张辉等[23]的研究结果一致;③ 根瘤菌为好氧菌，高温灭菌后土壤间隙增大，有利于植物与微生物的呼吸作用，这还有待于进一步研究。盆栽条件与大田生长条件相差很大，在复杂的田间环境下以上实验设计是否稳定发挥其促生作用，还有待田间实验验证。本研究并未测定根瘤菌在植物体内的定殖情况，有待于对根瘤菌进行标记，并结合激光共聚焦显微镜深入研究其在植物体内的定殖及分布规律。

[1] 胡小加, 黄沁洁, 张学江. 类黄酮促进根瘤菌侵染油菜根系的研究[J]. 土壤, 1999, (1): 43-45.

[2] Yanni YG, Rizk RY, AbdEI-Fattah FK, et al. The beneficial plant growth-promoting association ofRhizobiumleguminosarumbv.Trifoliiwith rice roots[J]. Australia J.Plant Physiol., 2001, 28(9):845-870.

[3] 张淑英. 根瘤菌的作用及其菌肥的施用[J]. 河北农业科技, 2000, (6):22.

[4] 张世光. 豆科植物生物固氮的调查研究[J]. 湖南农机, 2011, (7):207-208.

[5] 陈文新, 汪恩涛, 陈文峰. 根瘤菌-豆科植物共生多样性与地理环境的关系[J]. 中国农业科学, 2004, 37(1):81-86.

[6] 王洪隆, 康玉庆, 张存金. 非豆科作物结瘤固氮的途径[J]. 华北农学报, 1993, 8(4):111-114.

[7] Al-Mallah MK, Davey MR, Cocking EC. Formation of nodular structures on rice seedlings by rhizobia[J]. J Exp.Bot.,1989，(40):473-478.

[8] Al-Mallah MK, Davey MR, Cocking EC. Nodulation of oilseed rape(Brassicanapus) by rhizobia [J].J Exp.Bot.，1990, 41 (12): 1567-1572.

[9] 叶喜文, 焦峰, 吴金花,等. PGPR促生菌肥在水稻上应用效果研究[J]. 八一农垦大学学报, 2005, (1): 9-11.

[10]王平, 王勤, 冯新梅, 等．华癸根瘤菌在非豆科植物根圈定殖能力的研究[J]．华中农业大学学报, 1999, 18 (3):238-242．

[11]张晓霞, 王平, 冯新梅, 等. 对水稻有促生作用的紫云英根瘤菌筛选初报[J]. 土壤肥料, 2001，(6):30-33.

[12]马天瑞, 蓝祖庆. 对小麦有促生作用的苜蓿根瘤菌筛选初报[J]. 安徽农学通报, 2010, 16(21)：32-33.

[13]荆玉祥, 沈世华. 根瘤菌对非豆科植物定殖和促进生长作用的研究现状[A]. 第十一届全国土壤微生物学术讨论会论文集[C].长沙：第十一届全国土壤微生物学术讨论会,2010:23-24.

[14]李新民, 谷思玉, 窦新田, 等. 不同土壤大豆接种根瘤菌剂反应的研究[J]. 黑龙江农业科学, 1998, (4):1-5.

[15]李莉, 万正煌, 仲建锋, 等. 根瘤菌剂拌种和土壤条件对绿豆生长发育的影响[J]. 湖北农业科学, 2011, 50(24):5063-5066.

[16]韩梅,于芳,肖亦农, 等. 1株具解磷特性大豆根瘤菌的分离筛选与回接鉴定[J]. 微生物学杂志, 2010, (2):51-56.

[17]邓振山, 党军龙, 张海州, 等. 植物根际促生菌的筛选及其对玉米的促生作用[J]. 微生物学通报, 2012，39(7):982-983.

[18]岳思君, 李学斌, 李爱华, 等. 高酶活纤维素分解菌分离筛选的研究[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(1):11-12,15.

[19]牟志美, 路国兵, 冀宪领,等. 桑树内生拮抗细菌BurkholderiacepaciaLu10-1的分离鉴定及其内生定殖[J]. 微生物学报, 2008, 48(5):625-626.

[20]Baset Mia M A, Shamsuddin Z H.Rhizobiumas a cropenhancer and biofertilizer for increased cereal production[J]. African J.Biotechnol，2010,9(37):6001-6009.

[21]李婷, 何来, 梁泉峰. 非豆科植物的根瘤菌促生机制的研究进展[J]. 中国农业科技导报, 2013, 15(2):97-102.

[22]庄敬华, 杨长城, 牟连晓, 等. 土壤不同处理对木霉菌定殖及其生防效果的影响[J]. 植物保护, 2005, 31(6): 42-44.

[23]张辉, 张佳宝, 赵炳梓. 高温高压间歇灭菌对中国典型土壤性质的影响[J]. 土壤学报, 2011, 48(3):540-547.

Combined Rhizobium of Robinia pseudoacacia with Cellulose-decomposing Bacteria for Promoting Growth of Shanghai Green (Brassica chinensis) And Sorghum vulgare

DENG Zhen-shan, DU Yang, HE Xiao-long， ZHAO Rui-hua

(Coll.ofLifeSci.,Yan’anUni.,Yan’an716000)

The growth-promoting effect ofRhizobiumwith cellulose-decomposing bacteria (CDB) onSorghumvulgareand Shanghai green (Brassicachinensis) using pot experiment withRhizobiaand CDB single and mixed inoculation to the plants was carried out, using acupuncture, seed soaking, and leaf daubing three inoculation methods, and determine their various growth indices. The growth promotion effects ofRhizobiumcombined with CDB on sorghum of graminaceous crops and Shanghai green of dicotyledonous crops these two non-fabaceous crops were initially probed deeply into. The results showed that under the conditions of non-stab inoculation of combined with two kinds of bacteria (group B) had more significant effects on their growth promotion than that inoculated with singleRhizobium(group D). Under sterilized conditions, the growth rate of root length of Shanghai green was over 48.97% higher than that of group D, and the dried weight in group B ofS.vulgaregrew higher than 30.76%; Moreover, the other growth promotion indices of group B and D with sterilized pot experiment, the growth promotion rate was higher than that of the non-sterilized pot experiment. And in addition, the dried weight ofS.vulgarein group B, under sterilized conditions, the largest difference was the Shanghai green's fresh weight, under sterilized conditions it was higher by 47.13% than that under non-sterilized conditions. The growth promoting effect of combinedRhizobiumwith CDB onS.vulgareand Shanghai green of non-stab groups had significant effects on various growth promotion indices, these can provide an experimental foundation for further development of microbial fertilizer for crops of non-fabaceous family in the future.

RhizobiumofRobiniapseudoacacia; cellulose-decomposing bacteria (CDB); mixed inoculation; growth-promoting effect

陕西省自然科学基础计划项目(2013JM3004); 陕西省科技统筹创新工程项目(2012CGX7，2012KTZB03-02-03)；

邓振山 男，博士，副教授。主要从事微生物资源与利用和环境微生物研究。Tel: 0911-2332030, E-mail: zhenshandeng214@163.com

2015-03-19；

2015-05-11

Q939.96

A

1005-7021(2016)01-0036-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.007

陕西省协同创新计划项目(2015XT-34)；延安大学“陕北微生物资源与利用研究中心”科研机构专项基金