旋转蒸发结合GC-MS/MS测定白酒中氨基甲酸乙酯

冯向东，蔡开云，周　丹

(湖北稻花香酒业股份有限公司，湖北宜昌443100)

旋转蒸发结合GC-MS/MS测定白酒中氨基甲酸乙酯

冯向东，蔡开云，周丹

(湖北稻花香酒业股份有限公司，湖北宜昌443100)

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC），是发酵食物和酒精饮品在发酵或贮存过程中天然产生的一种致癌性污染物。以D5-氨基甲酸乙酯为内标，采用旋转蒸发结合GC-MS/MS法分析测定白酒中EC含量，完善优化实验条件，经实验分析得到最佳旋转蒸发温度为40℃。此条件下，旋转蒸发时间约为15min，标准工作曲线相关系数R2=0.99996,检出限为0.6μg/L，加标回收率在97.5%～100.5%之间，相对标准偏差RSD均＜5%，能够满足白酒中EC检测分析需要。

白酒； 氨基甲酸乙酯； 旋转蒸发；gC-MS/MS

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是发酵食物和酒精饮品在发酵或贮存过程中天然产生的污染物[1-2]。不同种类的酒精饮品的EC含量差异很大，例如水果白兰地中EC含量平均值是啤酒的600倍以上。酒精饮品中的各种物质及其分解物经发酵过程后均可产生EC。这些前体物质（如尿素、氰酸酯和瓜氨酸）与乙醇发生化学作用，在酒精饮品中产生EC，而产生的数量取决于光线和温度两大要素[3]。

食物内的EC可能令人类患癌，因而引起公众的关注。实验显示，EC可令实验动物患上各类癌症。2007年，国际癌症研究机构把EC重新分类为第2A组（“可能令人类患癌的物质”）[4-5]。EC潜在的致癌性促使许多国家和机构制定了其在发酵食品和酒精饮料中的限量标准，加拿大的卫生与预防部门规定，蒸馏酒中EC含量不得超过150μg/L[6]。

目前国内针对EC的测定均采用GB 5009.223— 2014《食品中氨基甲酸乙酯的测定》标准。但检测过程中发现以下几个问题：①样品前处理过程大量使用易挥发性有毒有害化学试剂，给环境和人体带来污染和危害，尤其是正己烷和乙醚；②样品在使用氮气吹干的过程中，乙醚挥发出来，乙醚的蒸汽与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、热极易爆炸燃烧，给实验室和测试人员带来安全隐患；③样品前处理耗时长，效率不高；④检测结果的重现性差。

郭学武等[7-8]在《GC-MS测定白酒中氨基甲酸乙酯不同预处理方法的比较》中总结了前人改进后的3种样品预处理方法分别是：固相萃取（SPE）、固相微萃取（SPE）、双水相萃取（LLE）。虽然相对于国标方法有所改进，但操作过程依旧繁琐、成本高、有机溶剂用量大。本实验采用旋转蒸发结合GC-MS/MS法，以D5-氨基甲酸乙酯为内标，建立快速、准确检测白酒中EC的方法，避免正己烷和乙醚等有毒有害试剂在测试中的使用，同时缩短样品前处理时间，提高检测效率。

1　材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

酒样：市售某白酒样品。

仪器：Agilent7890A-7000B三重四级杆串联气质联用仪，美国安捷伦公司；RE－52AA旋转蒸发仪，上海贤德实验仪器有限公司；无水硫酸钠小柱（2g,6m L）,ANPEL Laboratory Technology公司。

试剂：EC标准品溶液（CAS:51-79-6,浓度100μg/m L，纯度99.50%），ChemService公司；D5-氨基甲酸乙酯标准品（纯度＞98%）,德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇，色谱纯。

1.2实验方法

1.2.1仪器条件

色谱条件：色谱柱：ZB-WAXplus石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；进样口温度：250℃；程序升温：初始柱温80℃，保持0m in,以10℃/m in升至180℃，保持0min,再以50℃/m in升至250℃，保持5m in；载气：氦气（纯度＞99.999%）,流速1m L/m in；进样方式：不分流进样；进样量：1μL。

质谱条件：接口温度280℃，电离方式：电子轰击源（EI）；监测方式：MRM；EC、D5-EC定量离子分别为m/z：62和m/z：64；电离能量：70 eV；溶剂延时：5m in。

1.2.2标准溶液的配制

（1）EC标准溶液：100μg/m L的EC标准品溶液。

（2）D5-EC标准溶液。储备液：取0.1g D5-EC标准品用甲醇定容至100m L的容量瓶中，配制成1mg/m L的储备液，于4℃冰箱中保存备用。

（3）标准溶液：取1m L D5-EC储备液用甲醇定容至100m L，即为10mg/L的D5-EC内标使用液。

1.2.3标准曲线的绘制

标准曲线工作溶液的配制：用移液枪分别准确吸取100μg/m L EC标准溶液0μL、10μL、20μL、30μL、50μL、100μL于6个25m L的容量瓶中，各加入10mg/L的D5-EC内标使用液250μL，用甲醇定容至刻度。得到0、40μg/L、80μg/L、120μg/L、200μg/L、400μg/L的标准曲线工作溶液，每个容量瓶中内标物D5-EC的浓度均为100μg/L，现配现用。

标准曲线的绘制：将各个浓度的标准曲线工作溶液依次进行GC-MS/MS分析，对EC-D5EC峰面积比值和EC-D5EC浓度比绘制标准曲线并得出其回归方程和相关系数。

1.2.4样品的处理与测定

准确称取5g（精确至0.01g）白酒样品，加入50μL 10mg/L D5-EC内标使用液，摇匀后在旋转蒸发仪上以一定温度浓缩至近干（约0.5m L），加甲醇2m L摇匀后过无水硫酸钠小柱，收集滤液，供GC-MS/MS分析。

2　结果与讨论

2.1线性关系及检出限

按1.2.2的方法绘制出的标准曲线见图1，其中ECD5EC峰面积比值为Y轴，EC-D5EC浓度比为X轴。

图1　标准工作曲线

由图1可知，其回归方程为Y=1.300943X，相关系数R2=0.99996，可见该标准曲线的线性关系较好，满足分析的要求。按信噪比S/N＝3推算，检出限为0.6μg/L。

2.2样品处理条件的优化及回收率

在1.2.4样品的处理中的关键点在旋转蒸发仪的温度控制，需要设置合适的蒸发温度以使白酒中干扰EC测定的物质去除，并且温度不能过高，以防止白酒样品中氨基甲酸乙酯挥发而造成测试结果不准确。

2.2.1不同蒸发温度下测试结果及加标回收率实验

酒样Y和加入一定EC标准溶液提高EC浓度后的酒样Y，分别经40℃、50℃、60℃、70℃、80℃旋转蒸发处理，经GC-MS/MS分析，测定结果对比见表1。

表1　不同蒸发温度下酒样Y的EC测试结果及加标后回收率

由表1可知，在40～80℃的5个梯度温度下，样品Y（未加标准物质）的EC测试结果在89.9～93.7μg/L之间，计算得RSD值为1.58%＜5%。可见在样品低浓度时（约＜100μg/L），旋转蒸发的温度变化对样品测试的结果基本无影响。

表2　40℃蒸发温度下酒样Y不同浓度的加标回收率实验

样品Y在加入一定量的标准物质后，使其理论浓度提高120μg/L（＞200μg/L），再分别经过40～80℃的5个梯度温度旋转蒸发，经GC-MS/MS分析测试。结果显示，加标回收率在40℃较好，为95.6%；50℃回收率较低，仅为74.5%；随着温度升高，加标回收率降低，80℃仅为67.8%。由此得出，样品高浓度条件（＞200μg/L）时，旋转蒸发的温度对测试结果准确度影响较大，分析原因可能是EC沸点为182～184℃，随着温度升高，样品中一部分EC挥发出去，造成测试结果偏低。

由上述实验初步得出，最佳的旋转蒸发温度应设置为40℃，此时样品EC测试的准确度较好。

2.2.240℃下不同浓度加标回收率实验

酒样Y加入一定梯度EC标准溶液提高EC浓度后，分别经40℃旋转蒸发处理，经GC-MS/MS分析，测定结果对比见表2。

由表2可知，在40℃旋转蒸发温度下，酒样Y不同浓度的加标回收率在97.5%～100.5%之间，计算得RSD值为1.35%。回收率很好，能满足不同浓度的样品EC测试要求。所以选定该方案的关键条件旋转蒸发温度为40℃，此时旋转蒸发时间约为15m in。

2.3精密度

取2种白酒样品按照上述方法进行样品处理（旋转蒸发温度40℃）和分析检测，每个样品做6次平行试验，计算该方法的精密度，结果见表3。

表3　测试方法的精密度　(μg/L)

由表3可知，实验中测试2种酒样EC含量的RSD值分别为1.0%和2.4%（＜5%,差异极不显著）。说明分析方法具有良好的重现性，可以满足白酒中EC的检测分析。

3　结论

以D5-氨基甲酸乙酯为内标，采用旋转蒸发结合GC-MS/MS法分析测定白酒中EC含量，经实验分析得到最佳旋转蒸发温度为40℃，此条件下，旋转蒸发时间约为15m in，加标回收率在97.5%～100.5%之间。2种酒样EC精密度实验RSD均＜5%，具有较好的重现性，能够满足白酒中EC检测的分析需要。

该方法对白酒蒸馏技术改进及自动化生产也提供了一种新思路。如果白酒中EC含量偏高，有给人体健康带来危害的风险，则可以采取控压、控温蒸馏的办法，使低沸点的乙醇等香味物质馏出，让高沸点的EC残留在原液中达到降低蒸馏酒中EC含量的目的，减少对人体健康危害的风险。

[1]高年发,宝菊花.氨基甲酸乙酯的研究进展[J].中国酿造,2006 (9)：1-4.

[2] 张庄英.白酒蒸馏和贮存过程中氨基甲酸乙酯的研究[D].无锡：江南大学,2014.

[3]Wu P,CaiC,Shen X,etal.Formation of ethylcarbamate and changesduring fermentation and storageof yellow ricew ine[J]. Food Chemistry,2014,152(6)：108-112.

[4]Baan R,Straif K,Grosse Y,etal.Carcinogenicity of alcoholic beverages[J].LancetOncology,2007,8(4)：292-293.

[5]Ronco A L,Acostag,Ferrog.The effectof smoking and drinking in oraland pharyngeal cancers:a case-controlstudy in Uruguay[J].Cancer Letters,2007,246：282-289.

[6]李安军,刘国英,汤有宏,等.SPE结合GC-MS法测定白酒中的氨基甲酸乙酯[J].酿酒科技,2014(12)：99-101.

[7]郭学武,李园子,黄世永,等.GC-MS测定白酒中氨基甲酸乙酯不同预处理方法的比较[J].现代食品科技,2016(32)：1-4.

[8]史斌斌,徐岩,范文来.顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)联用定量蒸馏酒中氨基甲酸乙酯[J].食品工业科技,2012,33(14)：60-63.

Detection of EC Content in Baijiu by Rotary Evaporation Coup led w ithgC-MS/MS

FENG Xiangdong,CAIKaiyun and ZHOU Dan
(Daohuaxiang Distillery Co.Ltd.,Yichang,Hubei443100,China)

EC is a kind of carcinogenic pollutants produced naturally in the fermentation/storage process of fermented food/alcoholic beverages.In this study,D5-EC used as the internal standard,rotary evaporation coupled w ithgC-MS/MSwasadopted formeasuring EC content in Baijiu.The optimum detection conditionswere summed up as follows:rotary evaporation temperaturewas at40℃,evaporation timewas 15 m in,R2=0.99996,the detection lim itwas 0.6μg/L,the recovery ratewasw ithin 97.5%～100.5%,and RSD＜5%.Suchmethod was suitable for the detection of EC content in Baijiu.(Trans.By YUEYang)

Baijiu;ethyl carbamate(EC);rotary evaporation;GC-MS/MS

TS262.3；TS261.4；TS261.7

A

1001-9286(2016)11-0120-03

10.13746/j.njkj.2016201

2016-06-15

冯向东(1972-)，男，高级质量工程师，一级食品检验师，一级品酒师。

优先数字出版时间：2016-08-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160803.1025.004.htm l。