葡萄酒中5-羟甲基糠醛含量的测定

刘　青，李志勇，张洋子，庞世琦，潘丙珍

(1.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东广州510623； 2.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东广州510623)

葡萄酒中5-羟甲基糠醛含量的测定

刘青1，2，李志勇1，2，张洋子1，2，庞世琦1，2，潘丙珍1，2

(1.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东广州510623； 2.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东广州510623)

葡萄酒中的5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfura，5-HMF）是生产及储存过程中由热降解反应而生成的产物，可以作为衡量葡萄酒是否过度受热和储存时间是否过长的指标。研究建立了高效液相色谱测定葡萄酒中5-HMF的方法，方法准确灵敏，重复性好。采用该法对我国河北昌黎、胶东半岛、天津和甘肃4个葡萄酒产区，以及法国、澳洲、葡萄牙和南非等41支国产和进口葡萄酒中的5-羟甲基糠醛含量进行测定，检出样品中羟甲基糠醛的含量范围为1.25～85.5mg/L。实验结果为我国葡萄酒品质监控提供有益的参考。

葡萄酒； 5-羟甲基糠醛； 高效液相色谱

5-羟甲基糠醛（5-HMF），又名5-羟甲基-2-呋喃甲醛，广泛存在于含糖类物质的食品中，如果汁、啤酒、蜂蜜、牛奶和果酒等[1]。葡萄酒由于生产及储存过程中不可避免发生热降解反应（蔗糖的焦化及还原糖的分解）从而导致5-HMF的产生或含量增加[2-3]。近年来，5-HMF的含量已成为衡量许多食品是否过度受热和储存时间是否过长的指标。

研究表明，5-HMF可能会引发并促进结肠小囊异常生长（ACF），还具有一定程度的基因毒性[4]。一定剂量的5-HMF被机体吸收后，会对眼、黏膜或皮肤有刺激性摄入过多会引起中毒，造成动物横纹肌麻痹和肝脏、肾脏、心脏等内脏器官损害[2-3，5]。目前国际上对5-HMF的毒副作用仍存有争议，欧盟食品安全委员会食品添加剂香料、加工助剂及食品接触材料科学小组认为每人每天摄入HMF的上限为1.6mg[3]，但也有相关文献报道5-HMF的每日允许摄入量为30～60mg[5]。国外多个食品协会已规定部分食品中5-HMF的含量，如美国香味料和萃取物质制造者协会规定5-HMF在酒类中的限量为10.0mg/kg[3]。然而，目前我国大部分食品中5-HMF的含量尚未有明确的限量标准，仅有国家标准GH/T 18796—2012《蜂蜜》规定了蜂蜜中5-HMF的限量为40mg/kg[6]，其他食品包括葡萄酒均无限量要求。在GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中也并未规定5-HMF的限量要求，且允许按实际生产需求添加[7]。

食品中5-HMF的测定方法多使用紫外吸光光度法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法或气相色谱-质谱法[8-15]，所适用的检测对象主要是啤酒、黄酒、蜂蜜、乳制品等食品[9-13]。本文通过实验，建立了葡萄酒中5-羟甲基糠醛的检测方法，方法操作简便，准确灵敏，能够满足日常进出口葡萄酒该指标的检测需要。采用所建立的方法对国产和进口的多支葡萄酒进行了检测，效果满意。

表1　葡萄酒样品信息汇总

1　材料与方法

1.1材料及仪器

样品：由超市购买、产地采样等方式，收集到我国胶东半岛、河北昌黎、天津和甘肃4个葡萄酒产区及日常进口法定委托检验的葡萄酒共计41个样品。样品情况汇总见表1。

试剂：5-羟甲基糠醛标准物质（纯度≥98%，CAS编号：67-47-0，购自Aldrich公司）；甲醇（色谱纯）；水采用GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》[16]中规定的一级水。水相微孔滤膜：0.45μm。

仪器设备：高效液相色谱仪Waterse2695：配有二极管阵列检测器，美国Waters公司；水平振荡器；超声波水浴；分析天平：感量0.01g。

1.2实验方法

1.2.1样品预处理

用移液管准确量取10.0m L的试样（起泡酒需预先脱气：将100m L试样倒入带排气塞的瓶中，在室温下使用水平振荡器或超声波水浴脱气，直至无气泡逸出）至100m L的容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容到刻度，混合均匀后经滤膜过滤后待测。

1.2.2标准品配制

标准储备液：准确称取适量的5-羟甲基糠醛的标准物质，用10%甲醇水溶液配制成浓度为200mg/L的标准储备溶液。该溶液在密封的棕色瓶中于0～4℃下可保存2～3个月。

标准中间溶液：准确量取标准储备溶液10.0m L于100m L容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容至刻度，配成浓度为20.0mg/L的标准中间溶液。该溶液在密封的棕色瓶中于0～4℃下可保存2～3个月。

标准工作溶液：分别准确量取标准中间溶液0.05m L、0.1m L、0.25m L、0.5m L、1.0m L、2.5m L于10m L容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容至刻度，分别配成0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L的标准工作溶液，现配现用。

1.2.3液相色谱条件

色谱柱：Welch Ulitimate C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱温：30℃；流动相：甲醇+水（1+9，v/v）；检测波长：284 nm；进样量：10μL；流速：1.0m L/m in。

1.2.4结果的计算

在上述的色谱条件（1.2.3）下，标准工作溶液和样品试液中的5-羟甲基糠醛经反相液相色谱柱分离后，在二极管阵列检测器284 nm处进行检测，以保留时间对样品，结合光谱图进行定性，标准曲线外标法对样品进行定量。5-羟甲基糠醛的参考保留时间为10.6m in。在相同实验条件下，样品与标准品工作溶液中待测物质的色谱峰相对保留时间的偏差应在2.5%以内。同时进行空白对照实验，除不添加样品试液外，其余步骤相同。

试样中5-羟甲基糠醛的含量由色谱数据处理软件或按式(1)计算获得，计算结果应扣除空白值。

式中：X——试样中5-羟甲基糠醛的含量，mg/L；

C——从工作曲线求得的试样溶液中5-羟甲基糠醛的含量（扣除空白），mg/L；

V——试样最终的定容体积，m L；

L——试样的取样体积，m L。

计算结果用平行测定的算数平均值表示，保留2位有效数字。

2　结果与讨论

2.1方法的验证

2.1.1检出限和定量限

方法的检出限采用添加法进行实际测定得到。基于概率统计学的原理，即通过检测目标物质5-HMF在葡萄酒典型代表基质——红葡萄酒、白葡萄酒和起泡酒中被有效检出的概率达到95%时的浓度水平来确定。对于葡萄酒的3种典型基质，以刚好能被有效检出的浓度水平作为参考浓度，以1～2倍该浓度水平作为参考检出限LODR独立检测6个以上，计算出其标准偏差SD值；以LODR-3SD、LODR、LODR+3SD 3个浓度水平分别检测20个标准物质，刚好有19个样品能被有效检出的浓度即为该方法的检出限。

综合3种基质检出限的验证试验，该方法葡萄酒中5-HMF的检出限为0.3mg/L。根据定量限须满足“≥3倍检出限”或其信噪比≥10，初步得出定量限为1.0mg/L。

2.1.2方法线性范围和回归方程

选择0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L共7个不同浓度标准溶液，通过平行测定6次来进行验证，以5-HMF浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程为y=6.62e+ 004X-1.80e+003，相关系数0.9997，该结果表明，在0.05～5.0mg/L浓度范围内，峰面积与5-HMF浓度呈现出良好的线性关系。

2.1.3正确度（回收率）和重复性

本方法的正确度是通过在空白基质中加标测定回收率来进行验证。分别选择以定量限、5倍定量限、10倍定量限、20倍定量限4个水平进行回收率试验，每个水平重复进行6次平行单独测定，测定结果详见表2。结果表明，该方法测定3种典型葡萄酒基质中5-HMF含量的总体平均回收率为88.4%～105.3%，方法的相对标准偏差为0.268%～3.74%，能够满足日常检测需要。

表2　3种典型葡萄酒基质中5-HMF回收率和重复性结果

2.1.4稳健性

为了验证方法的稳健性，选取了本次实验过程中的主要变量因素，每个变量取2个不同的水平，采用8种组合方式，分别对红葡萄酒和起泡葡萄酒进行分析方法的稳健性实验，实验结果分别见表3、表4。

表3　红葡萄酒稳健性实验结果

表4　起泡酒稳健性实验结果

对以上数据进行差值检验，将8个测定值按因素字母的顺序分成2组，计算各个因素的影响，如第一个因素柱温变化的影响可由1/4（s+t+u+v）和1/4（w+x+y+z）之间的差值di给出，其他几个因素依次类推。再根据公式计算环境等因素引起的标准偏差，对红葡萄酒的5种因素2个水平和起泡葡萄酒的7种因素2个水平进行数据统计，结果分别见表5和表6。通过将差值di与该分析方法在相同条件下重复测定的2倍标准偏差相比较，差值di均远远小于2倍方法标准偏差，说明该方法稳健性良好，各因素对该方法及其结果不会造成显著影响，即检测中某个因素参数产生微小变动后仍能获得较为一致、稳定的实验结果。

表5　红葡萄酒稳健性验证试验的数据统计

表6　起泡酒稳健性验证试验的数据统计

2.2葡萄酒样品中5-HMF含量的测定

使用本方法对收集的41个葡萄酒样品进行了检测，检测结果见表7。

表7　葡萄酒样品中5-HMF含量分析结果

由表7可知，有11个葡萄酒样品中检出5-HMF，多为半干白葡萄酒和冰葡萄酒，含量范围为1.25～85.5mg/L，其中甘肃冰葡萄酒中5-HMF含量高达85.5mg/L。结合葡萄酒样品中总糖含量检测结果和瓶标酒精度值分析，三者存在一定的相关性，即总糖含量高且酒精度相对较低的样品，如半干白葡萄酒和冰葡萄酒中5-HMF含量偏高。这可能与葡萄酒酿造工艺有关系，如使用热浸提法酿造葡萄酒或添加葡萄浓缩汁生产的葡萄酒可能会产生5-HMF或使其含量升高[17]。样品中检出5-羟基甲糠醛的色谱图和与标准的光谱比较图分别见图1和图2。

图1　冰葡萄酒中检出5-HMF的色谱图

图2　冰葡萄酒中检出5-HMF与标准的光谱比较图

3　结论

本实验经研究建立了葡萄酒中5-HMF的高效液相色谱检测方法，方法操作简单，灵敏度高，稳健性好。采用该方法对41个进口和国产不同类型的葡萄酒样品进行检测，结果表明，葡萄酒中酒精度偏低、总糖含量高的半干白葡萄酒和冰葡萄酒中，5-HMF含量相对较高。日常对葡萄酒中5-HMF的监控，应将半干的白葡萄酒和冰葡萄酒作为重点关注对象。

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Determ ination of 5-HydroxymethylfurfuralContent inW ine

LIU Qing1,2,LIZhiyong1,2,ZHANG Yangzi1,2,PANG Shiqi1,2and PAN Bingzhen1,2
(1.TechnicalCenterofguangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou,Guangdong 510623;2.Guangdong Key Lab of Importand ExportTechnicalMeasuresof Animal,Plantand Food,Guangzhou,Guangdong 510623,China)

5-hydroxymethylfurfural isa productderived from the thermaldegradation reaction during the production and the storage ofw ine.It is an indicator to judgewhether thew ine is overheated/the storage time is too long.In this study,themethod of detecting 5-HMF content in w ine by HPLC had been developed.Such method had the advantages including high accuracy,good sensitivity andgood reproducibility.5-HMF content in 41 domestic and imported w ine samples(from Changli,Shandong,Tianjing andgansu/from French,Australia,Portugal,etc.) was detected in the experimentsand the contentof 5-HMF of all detected sampleswas in the range of 1.25～85.5mg/L.The experimental results provided useful references formonitoringgrapew ine quality.

grapew ine;5-hydroxymethylfurfural;HPLC

TS262.6；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286(2016)11-0107-05

10.13746/j.njkj.2016220

广东省科技厅国际合作项目（2013B051000068）；广东省科技厅公益项目（2014A04041065）；广东检验检疫局科技项目（2015GDK36）。

2016-07-06

刘青（1971-），硕士，主要研究方向为食品质量安全检测，色谱、色谱质谱等检测技术应用等，E-mail：gdciqlq@163.com。

优先数字出版时间：2016-10-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161012.0937.004.htm l。