液相色谱-同位素比值质谱测定白酒中乙醇的碳同位素比值

钟其顶，王道兵，张　倩，谢正敏，陈　林，熊正河，肖冬光

（1.五粮液股份有限公司博士后工作站,四川宜宾644000； 2.中国食品发酵工业研究院,北京100027； 3.天津科技大学,天津300457)

液相色谱-同位素比值质谱测定白酒中乙醇的碳同位素比值

钟其顶1，2，3，王道兵2，张倩1，谢正敏1，陈林1，熊正河2，肖冬光3

（1.五粮液股份有限公司博士后工作站,四川宜宾644000； 2.中国食品发酵工业研究院,北京100027； 3.天津科技大学,天津300457)

特定化合物稳定同位素分析是近年来研究的重点，基于液相色谱-同位素比值质谱（LC-IRMS）技术建立了白酒中乙醇δ13C值的测定方法。分析了白酒挥发性组分对乙醇δ13C值测定的干扰，研究了流动相流速和色谱柱温度对白酒中乙醇分离及对δ13C值测定的影响，优化后的色谱条件为流速0.35m L/min，柱温30℃，样品中乙醇浓度范围为0.14～1.08g/L。方法的重复性和再现性标准偏差均优于0.09‰（n=10）。用该法和气相色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱技术同时测定10个白酒样品，两种方法的测定结果具有显著相关性关系（R2=0.999）。该法操作简单，检测限可低至0.14g/L，且结果更稳定、准确。

液相色谱-稳定同位素比值质谱； 稳定碳同位素组成（δ13C）； 乙醇； 白酒

中国传统白酒是世界著名的六大蒸馏酒之一，具有深厚的历史文化底蕴，是满足人们不断进步的物质文化和精神文化需求不可或缺的传统饮品。传统白酒一直以高端品质的形象示人，但近年来市场上却出现了廉价白酒冒充传统白酒的现象，这种造假行为不仅侵犯了消费者权益，也影响了传统固态酿造白酒行业的正常有序发展。因此，开发有效、灵敏的中国传统白酒真伪鉴别及掺假检测方法显得极为迫切。

稳定同位素比值质谱技术在食品真伪鉴别和掺杂检测中具有重要应用价值，目前已逐渐成为国际上用于确定食品真伪及检测食品成分掺假的一种直接而有效的手段[1-3]。为推动我国白酒产业健康、持久发展，中国酒业协会于2013年启动了“中国白酒3C计划”[4]，应用稳定同位素技术研究传统白酒中添加食用酒精的鉴别技术获得了行业和企业的大力支持，也取得了一些研究成果[5-8]，为下一步开展白酒真实性技术标准研究、规范白酒市场、保护消费者利益打下了基础。

乙醇碳同位素比值（δ13C）的测定方法主要有蒸馏提取-元素分析/稳定同位素比值质谱法[9]、顶空萃取-气相色谱/燃烧/稳定同位素比值质谱法[10-12]、直接进样-气相色谱/燃烧/稳定同位素比值质谱法[13]和稀释进样-气相色谱/燃烧/稳定同位素比值质谱法[5-8，14]，这些方法在不同国家、不同领域均有所应用。近年来出现了液相色谱-稳定同位素比值质谱法（LC-IRMS）测定特定化合物稳定碳同位素组成的一些研究报道[15-16]，由于其对大分子有机物具有良好的分离特性，在我国蜂蜜和果汁的掺假鉴别研究和质量控制方面也出现了一些研究与应用[17-19]，但尚未有应用该技术对白酒中乙醇δ13C进行分析研究的报道。本实验采用液相色谱-稳定同位素比值质谱技术建立了测定白酒中乙醇δ13C的分析方法，分析了色谱条件等因素对分析结果的影响，并与GC-C-IRMS的分析结果进行了对比。

1　材料与方法

1.1材料、仪器与试剂

酒样：10个白酒样品分别购自北京家乐福超市。

试剂：无水乙醇（HPLC级）购自国药集团化学试剂有限公司，乙醛、正丙醇、仲丁醇、异丁醇、异戊醇、叔戊醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乳酸、己酸均购自百灵威科技公司。

液相色谱-稳定同位素比值质谱仪（LC-IRMS）：美国ThermoFisher公司的MAT 253同位素质谱仪，配备IsoLink接口与Dionex液相色谱。

气相色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱仪（GC-CIRMS）：美国ThermoFisher公司的Delta V Advantage同位素质谱仪，配备IsoLink接口与ThermoFisher公司的Ultra TraceGC气相色谱（配Triplus自动进样器）。

LC-IRMS使用的超纯水由M illipore公司的M illi-Q系统制备。正磷酸（纯度≥99%）、过二硫酸钠（纯度≥99%）均购于Sigma-A ldrich公司；保护气为氦气（纯度≥99.999%），购于北京市北温气体制造厂；工作参考气：二氧化碳（纯度≥99.99%），购于北京市北温气体制造厂。配制0.2mol/L磷酸溶液和0.2mol/L过二硫酸钠溶液，存于棕色瓶内，用前使用真空抽滤装置除杂、用超声波脱气。

蔗糖IAEA-CH-6（δ13CPDB值为-10.45‰±0.2‰）购于奥地利维也纳国际原子能机构，作为碳稳定同位素比值分析的参考物质。

1.2样品处理

使用超纯水将样品稀释至乙醇浓度约用0.27g/L，用0.22μm尼龙滤膜过滤，转移至样品瓶中供LC-IRMS测定乙醇δ13C值。

1.3实验条件

LC-IRMS条件：色谱柱为Hyper REZ XPCarbohydrate H+柱（300mm×7.7mm，8μm，ThermoFisher公司）；流动相为超纯水，流速为350μL/m in；柱温为30℃，进样体积为10μL。磷酸溶液和过二硫酸钠溶液作为反应助剂，流速为0.05m L/m in以将色谱分离的有机物转化成CO2。

1.4校准与计算

基于国际基准物质V-PDB（Vienna Pee Dee Belemnite Standard，13C/12C=0.0112372）得出样品中乙醇的δ13C值（‰）：δ13C=（13C/12C）sample/（13C/12C）VPDB-1。本研究中选择IAEA-CH-6作为实际测定中的参考物质。

2　结果与讨论

2.1测定条件优化

稳定同位素比值质谱仪具有很高的灵敏度，极易受环境因素及仪器本身状态的影响，因此确保仪器状态稳定是进行样品分析的前提。实验室保持恒温恒湿（温度变化不超过1℃/h），提前对色谱柱进行必要的老化并通入反应助剂，待达到分析指标后再进行样品测试。

2.1.1白酒中其他有机物的影响

液相色谱-稳定同位素比值质谱技术分析的是特定分子的碳稳定同位素组成（CSIA）[16]，因此目标物与基质中的其他组分应达到较好的基线分离效果才能不受干扰。由于白酒中除乙醇外还有其他高级醇、酸、酯类物质，为评估乙醇与其他有机物是否达到了基线分离，因此取相同体积的乙醇、乙醛、正丙醇、乙酸乙酯等物质混合并稀释后用LC-IRMS（流速0.25m L/m in，30℃）分析，结果见图1。

图1　高浓度混标中乙醇δ13C离子流图

图1中，乙醇的保留时间为2992 s，由此可知，当前色谱条件下色谱柱对乙醇有较好的分离效果。然而，通过检测多种白酒样品，发现LC-IRMS的离子流图中只有乙醇产生了明显的CO2峰（如图2），这可能是由于白酒中除乙醇外的其他有机物只占白酒体积的1%左右，样品稀释至乙醇含量为0.27g/L时其他有机物也相应的被稀释了几千倍，进样后由于含量太低因而与LC-IRMS的背景值融为一体的缘故。因此，本方法测定白酒乙醇δ13C值时可不必考虑高级醇酯等物质影响。

图2　白酒中乙醇δ13C的离子流图

2.1.2乙醇浓度对δ13C测定的影响

IRMS测定碳稳定同位素比值时需要比较样品与CO2参考气的m/z 44、m/z 45和m/z 46的离子流信号，因此，应评估样品产生的CO2信号量对测定的影响[20]。本研究采用无水乙醇为研究对象，分别配制成0.03g/L、0.07g/L、0.14g/L、0.27g/L、0.54g/L、1.08g/L和2.16g/L的乙醇水溶液，10μL进样后得到了500～14000mV的信号强度（m/z 44）梯度，并测定各溶液中乙醇的δ13C值，重复测定5次。如图3所示，当乙醇浓度为0.03～1.08g/L时，信号强度与乙醇浓度呈正比关系，但是当浓度为2.16g/L时，虽然乙醇含量比1.08g/L的溶液增加了1倍，信号强度却只增加了三分之一，并且峰形变差（图4），这是因为该反应体系利用氧化剂（过二磷酸钠）将乙醇转化成CO2，而当前浓度的过二磷酸钠溶液（0.2mol/L）不足以处理过高浓度乙醇的缘故。对比不同乙醇浓度时的δ13C测定结果（图3、图4）可知，样品信号强度处于1500～11000mV时能得到稳定的测定结果，因此样品分析时乙醇浓度在0.14～1.08g/L时测定结果最佳，本实验选择0.27g/L作为后续研究过程的样品进样浓度。

图3　乙醇浓度对δ13C测定的影响

2.1.3色谱柱温度的影响

有文献指出色谱柱温度较低会导致被测组分氧化不完全，影响LC-IRMS测定结果的稳定性，因此建议使用较高的色谱柱温度[21]。本研究使用无水乙醇和一个白酒样品作为研究对象对色谱柱温度的影响进行了验证分析，每个温度梯度下，无水乙醇和白酒样品均测定3遍，结果见表1。

图4　高浓度乙醇溶液中δ13C的离子流图

表1　色谱柱温度对乙醇δ13C测定的影响

由表1可知，色谱柱在30～65℃范围时，乙醇δ13C的测定结果是稳定的（标准偏差≤0.06‰），不同温度时的测定结果也无差异（极差＜0.15‰），这说明该LC-IRMS配套Hyper REZ XPCarbohydrate H+测定乙醇δ13C值时不存在低温条件下乙醇氧化不完全的情况，即白酒乙醇δ13C值测定稳定性不受色谱柱温度的影响。

高效液相色谱的应用研究表明，较高的色谱柱温度可以提高分析流速[22]，但是本研究发现，LC-IRMS测定乙醇δ13C时乙醇的保留时间与色谱柱温度呈反相关关系：流动相流速为0.4m L/m in时，色谱柱65℃时，乙醇的保留时间相比30℃推迟了82 s。考虑到温度对色谱柱寿命的影响以及分析效率，选择30℃作为该体系下测定乙醇δ13C值的色谱条件。

2.1.4流动相流速的影响

有研究认为[21]流动相流速会影响分析组分δ13C测定的重复性和再现性，本文以无水乙醇为研究对象研究了流动相流速为0.25～0.45m L/m in时乙醇δ13C测定值的变化特性，结果见表2（每个流速梯度下，样品均测定3遍）。

表2　流速对乙醇δ13C测定的影响

由表2可知，流动相流速固定时乙醇δ13C测定结果是很稳定的，因此实际分析过程中可以在0.25～0.45m L/m in范围内任意设定一个流速参数。然而，比较不同流速时的测定结果可发现乙醇δ13C测定值因流速改变而变化，表现出先偏负后偏正的趋势，这可能与不同流速时氧化剂与目标组分是否充分反应有关，但根据“IT原则”（Identical TreatmentPrinciple）[23]，由于固定流速时δ13C测定结果稳定，可以通过工作标准或同位素参考物质进行校正处理[24]。因此，本方法采用0.35m L/m in作为流动相流速。

2.2方法精密度

根据GB/T 6379.1—2004，在重复性条件下对无水乙醇和白酒样品中乙醇的δ13C分别连续测定10次，在再现性条件下，10 d内对相同的无水乙醇、白酒样品完成10次独立测定，结果见表3，可见测定乙醇δ13C的标准偏差（SD）为0.01‰～0.09‰，重复性和再现性均优于气相色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱法[5-6]，满足检测需求。

表3　LC-IRMS测定乙醇δ13C的重复性和再现性

2.3方法准确性

笔者所在的研究团队于2011年开发了气相色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱仪（GC-C-IRMS）测定饮料酒中乙醇δ13C的方法[5-8]，并通过了欧盟组织的稳定同位素实验室间的能力验证，目前该方法已被采纳为行业标准[25]。由于缺少乙醇碳同位素的参考物质，因而不能通过直接测量参考物质的形式对LC-IRMS测定乙醇δ13C的准确性进行验证。为研究本方法的准确分析能力，分别采用本方法和GC-C-IRMS测定10个白酒样品中乙醇的δ13C值，结果见表4。

表4　LC-IRMS和GC-C-IRMS测定10个白酒样品中乙醇δ13C值的比较

由表4可知，采用本方法测定的白酒乙醇δ13C值与GC-C-IRMS方法相比，测定结果的差值均小于0.25‰，线性相关程度达0.999，说明本方法测定白酒样品中乙醇的δ13C值准确有效，满足国际标准检查方法的质量控制要求[26]。

3　结论及展望

应用液相色谱-稳定同位素比值质谱技术测定白酒中乙醇δ13C值的方法。所建立的方法具有前处理简单的特性，且重复性和再现性结果均较好。与气相色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱技术对比验证了本方法的准确性。该方法为我国白酒乙醇碳同位素分析提供了技术手段，为我国白酒的碳同位素检测技术与国际接轨、建立我国白酒同位素数据库以及白酒真伪鉴别技术研究提供了方法支持。

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Determ ination of Carbon Isotope Ratio of Ethanol in Baijiu by Liquid Chromatography Coup led w ith Isotope Ratio MS

ZHONG Qiding1,2,3,WANG Daobing2,ZHANG Qian1,XIE Zhengm in1, CHEN Lin1,XIONG Zhenghe2and XIAODongguang3
(1.PostdoctoralResearch Institute ofWuliangye Co.Ltd.,Yibin,Sichuan 644000;2.China National Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027;3.Tianjin University of Scienceand Technology,Tianjin 300457,China)

Compound-specific stable isotope analysis(CSIA)hasbecome the research focus in recentyears.On the basisof S&T development, the determ ination of ethanolδ13C isotope ratio of Baijiu by liquid chromatography coupled w ith isotope ratio mass spectrometry(LC-IRMS) has been developed.In this study,several parameters influencing the separation of ethanol from liquormatrix and influencing themeasurement ofδ13C of ethanolwere investigated and then optimized as follows:mobile phasewas at0.35m L/min,column temperature at 30℃,ethanol concentration for injectionwas in the range of 0.14g/L to 1.08g/L.The results showed that the analytic precision of themethod was better than 0.09‰(n=10).10 liquor sampleswere determ ined by thismethod and by the officialmethod(gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry)respectively.There were significant correlations(R2=0.999)between themeasured results of the twomethods.LC-IRMS had the advantages including simple operation,low detection lim it(0.14g/L),and high accuracy.

liquid chromatography coupled w ith isotope ratiomass spectrometry;stable carbon isotope ratio(δ13C);ethanol;Baijiu

TS262.3；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286（2016）11-0049-05

10.13746/j.njkj.2016298

国家国际科技合作专项（2015DFA31720），北京市科技新星计划（xx2016B079）。

2016-10-10

钟其顶（1980-），男，高级工程师，博士，在读博士后，研究方向为稳定同位素食品分析技术，E-mail：zhongqiding@163.com。