调节黑曲霉脂肪酶催化合成己酸乙酯的探索

詹美榕，丁俊竹，丛方地，，邢克智，周文礼，张树林

（1.天津农学院基础科学学院生物制药系，天津300384； 2.天津市水产生态与养殖重点实验室，天津300384）

调节黑曲霉脂肪酶催化合成己酸乙酯的探索

詹美榕1，丁俊竹1，丛方地1，2，邢克智2，周文礼2，张树林2

（1.天津农学院基础科学学院生物制药系，天津300384； 2.天津市水产生态与养殖重点实验室，天津300384）

为提高己酸乙酯的酶促合成效果，通过物理吸附，将黑曲霉脂肪酶（Aspergillus niger Lipase,ANL）固定在柱形玻璃瓶的内壁上，形成简易的生物反应器，用于催化己酸和无水乙醇反应，合成己酸乙酯。在己酸与乙醇的体积比为0.6∶3.5的无溶剂体系中，酶的用量占反应体系0.24%，反应条件为37℃、160 r/min。研究表明，固定化过程中，水可以优化ANL的催化活性，羧甲基纤维素CMC能更好地优化ANL。在催化过程中，无水硫酸钠可以通过吸水作用，拉动平衡增大转化率，无水碳酸钠可中和己酸，进一步提高反应的转化率。反应时间24 h，转化率最高可达91.0%。

己酸乙酯； 脂肪酶； 固定化； 催化活性； 非水相

己酸乙酯是符合我国食品卫生安全标准的食用香料，用途十分广泛[1]，尤其它是浓香型白酒的主体香味成分[2]，市场需求量极大[3]，需要通过合成来提供[4]。合成己酸乙酯通常采用的化学催化合成法，副产物多，后期处理困难且严重腐蚀实验设备，对环境也有严重污染[5]。而酶催化合成法，具有效率高、有选择性及条件温和等优点[6]因此，此法副产物少、环境友好且对设备无特殊要求[7]用于合成己酸乙酯时，产品质量高，香味醇正[8]。特别是非水相中的脂肪酶催化方法[9]，利于酯的形成，用于合成己酸乙酯更为方便[10]。脂肪酶催化合成己酸乙酯多使用有机介质，如正己烷或正庚烷溶剂下催化合成[11]，而酶催化己酸和无水乙醇合成己酸乙酯的无溶剂体系，产品后期处理更简单，环境污染较小，但因为反应体系的极性较高，易造成酶蛋白变性而降低催化活性，所以现在对无溶剂体系酶催化合成己酸乙酯的研究相对较少[12]。本研究拟通过固定化、吸水剂和中和试剂的调节作用，稳定黑曲霉脂肪酶（Aspergillusniger Lipase,ANL）的催化活性，提高无溶剂体系酶催化合成己酸乙酯的效果。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

材料：黑曲霉脂肪酶ANL购于杭州创科生物科技有限公司（12000 U/g），羧甲基纤维素（CMC）由施瑞客（天津）生物技术有限公司提供，正己酸、无水乙醇和无机盐皆为分析纯。

仪器：全温振荡器（HZQ-Q，哈尔滨）；气相色谱仪(GC，Echrom A90，上海)，配有氢火焰检测器和毛细管柱（SE-30 30m×0.32mm×0.33μm）。

1.2 ANL固定化

在10m L柱形玻璃瓶内，加10mg的ANL酶粉，再加0.2m L浓度为0.05%的CMC溶液（或0.2m L水），将其敞口固定在全温振荡器中，以37℃、160 r/m in保持7 h以上，至恒重，得固定于瓶内壁上的固定化酶CMC-ANL（或水-ANL）。

1.3 酶促反应

向含有ANL酶粉、水-ANL或CMC-PCL的柱形玻璃瓶反应器（3种酶制剂含ANL皆为10mg）中，加入0.6m L正己酸和3.5m L无水乙醇（mol:mol,1∶12.5），封口后固定在恒温振荡器中，以37℃、160 r/m in反应。

1.4 调节反应

向上述含有3种酶制剂和反应液的3个反应器中，分别加入10mg的无水Na2SO4或无水Na2SO4+无水Na2CO3（各10mg），然后封口并固定在恒温摇床中，以37℃、160 r/min保持24 h。

1.5 动力学分析

取反应液1μL，用1m L正己烷稀释，经0.25μL微孔滤膜过滤，然后进行GC分析。进样口温度280℃，压力3 psi；柱程序：130℃保留5 m in，以80℃/m in升至280℃，保留6m in；检测器温度300℃。己酸和己酸乙酯的保留时间分别为：7.58m in和7.86m in。转化率c(%)按下式计算：

2 结果与讨论

2.1 ANL酶促反应动力学

图1 酶促合成己酸乙酯

ANL酶催化己酸与无水乙醇发生酯化反应生成己酸乙酯，见图1。为利于反应向右进行，乙醇使用过量。ANL酶粉、水-ANL和CMC-ANL催化合成乙酸己酯反应的动力学曲线见图2，它们转化底物的能力由小到大的次序为ANL酶粉＜水-ANL＜CMC-ANL。这是因为，在有机体系中，酶蛋白容易变性[13]，因而ANL酶粉活性较低。固定化过程中，使用的水在一定程度上可以优化酶蛋白，因而水-ANL的活性高于酶粉。固定化过程中，使用的CMC是一种多羟基大分子[14]，类似于水分子，可替代水在有机相中稳定酶的构象[15]，因而CMC-ANL活性更高。

图2 3种ANL催化合成己酸乙酯反应的转化率

2.2 无水Na2SO4对反应平衡的拉动

依据参考文献[16]，ANL催化合成己酸乙酯的条件设为37℃和160 r/m in。因反应有水生成（如图1），向反应体系中加入吸水剂，理应拉动反应向右进行。加入10mg无水Na2SO4后，反应的转化率有明显提高，ANL酶粉、水-ANL和CMC-ANL催化的反应体系的转化率分别提高到61.6%、74.4%和82.7%（表1）。相对于未加吸水剂之前，转化率分别提高了7.4%、9.7%和10.2%。尤其是在CMC-ANL催化的反应体系中，无水Na2SO4使反应转化率明显升高，约增加10.2%/10mg Na2SO4；而在硅胶作为吸水剂的正己烷溶剂体系中，经计算，约增加1.2%/10mg硅胶[17]，前者是后者的8.3倍。在具体生产过程中，如果要进一步提高转化率，可适当再增加无水Na2SO4的用量。

表1 Na2SO4和Na2CO3对反应转化率的影响

2.3 中和剂对酶催化作用的影响

ANL的最佳作用pH值为8[18]，因此与非极性溶剂体系相比较[17]，在极性较大的己酸和乙醇的混合液中，己酸能电离出质子，不利于ANL发挥催化作用的。为此，研究设想用无水Na2CO3来中和反应体系中的过多质子。结果表明，在Na2SO4和Na2CO3共存时，能够更有效地提高反应体系的转化率，使ANL酶粉、水-ANL和CMCANL催化的反应转化率分别进一步提高到72.3%、81.9%和91.0%（表1）。相对于未加无水Na2CO3的体系，转化率又分别提高了10.6%、7.5%和8.3%。尤其是CMC-ANL催化的反应体系，CMC、Na2SO4和Na2CO3共同作用的结果，使转化率达到91.0%（见图3）。

图3 Na2SO4和Na2CO3共存在时CMC-ANL催化反应24 h的GC图

3 结论

以0.2m L浓度为0.05%的CMC水溶液，溶解脂肪酶ANL，通过物理吸附法，将其固定在玻璃瓶壁上，制备出固定化酶CMC-ANL，与反应器一起形成简易的固定化酶生物反应器。在催化合成己酸乙酯的无溶剂体系过程中，CMC-ANL的非水相活性和稳定性明显增加。添加吸水剂无水Na2SO4可以拉动反应，使反应转化率从72.5%上升到82.7%，添加中和剂无水Na2CO3，可以使反应转化率进一步上升到91.0%。

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Exp loring the Regulation of Synthesisof EthylCaproate Catalyzed by Aspergillusniger Lipase

ZHAN Meirong1,DING Junzhu1,CONG Fangdi1,2,XING Kezhi2,ZHOUWenli2and ZHANG Shulin2
(1.Departmentof Biopharmaceutics,College of Basic Science,Tianjin AgriculturalUniversity,Tianjin 300384; 2.Tianjin Key Lab ofAquatic Ecology and Aquaculture,Tianjin 300384,China)

To improve the catalysis of Aspergillus niger lipase(ANL)in the synthesis of ethyl caproate,lipasewas immobilized on the inner wallof column glassbottle by physical absorption to form a facile bioreactor and then used in the reaction of caproic acid w ith ethanol to synthesize ethyl caproate.In solvent-free system w ith caproic acid and ethanol in a ratio of 0.6∶3.5(V∶V),ANL dosagewas 0.24%of this reaction system to catalyze theesterification at37℃and 160 r/min.Itwas showed that,water employed in the immobilization couldmodify the catalysisof ANL and carboxymethyl cellulose(CMC)could give better help on ANL.During the course of catalysis,anhydrous sodium sulfate could absorbwaterand pull reaction equilibrium to enhance reaction conversion,and anhydrous sodium carbonate could neutralize caproic acid to further increase reaction conversion.After24 h,the reaction conversion achieved at91.0%.

ethylcaproate;lipase;immobilization;catalytic activity;nonaqueousphase

TS262.3；TS261.4；Q814

A

1001-9286（2016）12-0028-03

10.13746/j.njkj.2016270

天津市水产生态及养殖重点实验室开放基金项目(TJAE201502)；国家自然科学基金项目(31270456)。

2016-09-05

詹美榕（1993-），女，研究方向：食品添加剂的酶促合成。

丛方地。

优先数字出版时间：2016-11-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161104.1415.004.htm l。