高效液相色谱法测定复方鱼腥草颗粒中黄芩苷和黄芩素含量

匡 钊

(江苏省扬州市食品药品检验检测中心，江苏 扬州 225009)



高效液相色谱法测定复方鱼腥草颗粒中黄芩苷和黄芩素含量

匡 钊

(江苏省扬州市食品药品检验检测中心，江苏 扬州 225009)

目的 建立同时测定复方鱼腥草颗粒中黄芩苷和黄芩素含量的方法。方法 采用高效液相色谱法，以Thermo-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱，以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相，进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，检测波长为274 nm，柱温为25 ℃。结果 可在30 min内完成对黄芩苷和黄芩素的色谱分析，测得的黄芩苷的线性范围为0.069～0.34 mg/mL，r=0.999 8，平均回收率为99.5%(RSD=3.33%)；黄芩素的线性范围为0.005～0.025 mg/mL，r=0.999 4，平均回收率为102.7%(RSD=2.44%)。结论 所建立的高效液相色谱法方便快捷、准确、简便、重复性好，可用于复方鱼腥草颗粒的质量控制。

复方鱼腥草颗粒；黄芩苷；黄芩素；高效液相色谱法

复方鱼腥草颗粒是由复方鱼腥草片改型的中药四类新药，主要是由鱼腥草、黄芩、板蓝根、连翘、金银花组成，其中黄芩性寒味苦，可以用于清热燥湿、泻火解毒；鱼腥草性微寒味腥，具有清热解毒、利尿排脓的功效，并且能够抗炎，抗病毒，增强机体的免疫力；板蓝根性寒味苦，不仅清热解毒，而且凉血利咽，与鱼腥草合用可以增强其清热解毒的作用；金银花性寒味苦，具备疏散风热、清热解毒的功效；连翘性微寒味苦，具有清热解毒、消肿散结的效用[1-2]。

复方鱼腥草颗粒可以清热毒、散风邪、消肿痛，对细菌和病毒均有显著的抑制作用，是治疗小儿急性上呼吸道感染[1-2]、小儿急性扁桃体炎风热证[3]、小儿急性支气管肺炎[4]等病证的有效药物。

方中黄芩既助君药清热解毒，又可泻火通腑，使邪有出路，功兼佐使[5]。黄芩的主要活性成分为黄芩苷等黄酮类化合物，而现代药理研究[6-7]表明，黄芩苷和黄芩素具有抗菌、抗氧化、解热、镇痛抗炎、抗病毒、抗变态反应的作用。因此，已有人采用薄层扫描法[8]、UPLC-MS/MS法[9]、高效液相色谱法[10]等方法对黄芩中黄芩苷和黄芩素的含量测定方法进行了研究。

目前，复方鱼腥草颗粒在国内仅由邦琪药业独家生产，执行标准为国家食品药品监督管理局新药转正标准第62册，该标准对方中鱼腥草、连翘、金银花进行初步的质量控制(即薄层鉴别)，含量测定则以黄芩中黄芩苷的含量(每袋不得少于48.0 mg)为准，这具有一定的片面性，给药品的质量监测带来一定难度。本研究通过建立合理高效的高效液相色谱法来同时测定黄芩苷和黄芩素的含量，从而进一步加强对复方鱼腥草颗粒的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦LC1260高效液相色谱仪系统：安捷伦科技(中国)有限公司，主要由G1311C高压输液泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G1314B紫外检测器和M8301AA色谱工作站组成；MS204S电子天平：梅特勒-托利多；KH-400KDB高功率数控超声波清洗器：江苏省昆山禾创超声仪器有限公司；Millipore超纯水机。

1.2 试药 黄芩苷(baicalin)对照品：中国食品药品检定研究院，批号 110715-201117，含量91.7%；黄芩素(baicalein)对照品：中国药品生物制品检定所，批号 11595-200301；复方鱼腥草颗粒：广西邦琪药业集团有限公司，批号分别为140403、140515、140711；乙腈(色谱纯)：DIKMA科技公司；甲酸(分析纯)、甲醇(分析醇)、乙醇(分析醇)：国药集团化学试剂有限公司；去离子水：由扬州市食品药品检验检测中心自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Thermo-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～15 min，28% A，72% B；16～40 min，45% A，55% B；41～45 min，28% A，72% B)；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：274 nm；柱温：25 ℃；进样量10 μL。在此色谱条件下，样品中黄芩苷和黄芩素能达到有效分离。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品储备液 分别精密称取黄芩苷对照品124.6 mg、黄芩素对照品12.6 mg至200 mL和100 mL棕色容量瓶，加入适量的70%甲醇溶液，超声使溶解，再用70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，分别制成0.571 3 mg/mL的黄芩苷对照品溶液和0.126 mg/mL的黄芩素对照品溶液，作为对照品储备液。

2.2.2 混合对照品溶液 精密吸取黄芩苷对照品储备液9 mL、黄芩素对照品储备液3 mL于同一25 mL棕色容量瓶中，然后用70%的甲醇溶液稀释至刻度，混匀，即得0.205 7 mg/mL黄芩苷、0.015 12 mg/mL黄芩素的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 取复方鱼腥草颗粒6 g，研细，精密称定1.0 g，至100 mL具塞锥形瓶中，精密加70%甲醇溶液50 mL，称定质量，超声提取20 min，放冷，用70%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜(上海半岛实业有限公司净化器材厂)后，得到的滤液作为供试品溶液。

2.2.4 阴性样品溶液 按复方鱼腥草颗粒的处方比例称取鱼腥草、板蓝根、连翘、金银花这四味药材，按照复方鱼腥草颗粒的制备工艺制成不含黄芩的阴性样品，并按“2.2.3”项下操作方法，制得阴性样品溶液。

2.3 系统适应性试验和方法专属性考察 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，在“2.1”项下的色谱条件下测定，结果在对照品色谱和复方鱼腥草颗粒供试品色谱图的相应位置(保留时间为8.239、22.254 min)上，确认了黄芩苷和黄芩素的吸收峰，且黄芩苷、黄芩素色谱峰与其相邻色谱峰的分离度远大于1.5。通过对混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液色谱图的比较，可以看出，阴性样品溶液的色谱图中没有黄芩苷和黄芩素的吸收峰，故可认为处方中的其他成分对测定结果无影响。混和对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液的色谱图分别见图1。

图1 混合对照品(A)、供试品(B)和阴性样品(C)溶液的高效液相色谱图(1.黄芩苷;2.黄芩素)

2.4 线性关系试验 精密吸取黄芩苷对照品储备液3、6、9、12、15 mL，黄芩素对照品储备液1、2、3、4、5 mL，分别置于5个25 mL棕色容量瓶中，加70%的甲醇溶液定容，摇匀，得5个不同浓度的混合对照品溶液。按照“2.1”项下的色谱条件进样测定，以浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制黄芩苷和黄芩素的标准曲线。结果表明，黄芩苷的进样量在0.068 55～0.342 8 mg/mL范围内，黄芩素的进样量在0.005 04～0.025 2 mg/mL的范围内，浓度与峰面积的线性关系良好(黄芩苷：Y=35 061X+31.756，r=0.999 8；黄芩素：Y=54 373X-43.722，r=0.999 4)。

2.5 精密度试验 取“2.2.2”项下的混合对照品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件，连续进样6次，每次10 μL，分析黄芩苷和黄芩素的峰面积，计算得黄芩苷和黄芩素峰面积的RSD分别为0.426 9%和0.843 9%。结果表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批号的复方鱼腥草颗粒(批号 140515)约10 g，按照“2.2.3”项下的供试品制备方法，平行制备6份供试品溶液，然后在“2.1”项下的色谱条件下进样，由仪器分析得到的黄芩苷和黄芩素的峰面积分别计算出6组黄芩苷和黄芩素的含量，结果黄芩苷和黄芩素的平均含量分别为8.791 1、0.473 8 mg/g，其RSD分别为0.428 1%、0.810 6%，表明方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一批号的复方鱼腥草颗粒(批号 140515)约1 g，按照“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液，然后分别在0、3、6、9、12、24 h时按照“2.1”项下的色谱条件进行分析，经计算黄芩苷和黄芩素峰面积的RSD分别为0.124 1%、0.585 0%。结果表明，样品中黄芩苷和黄芩素在室温条件下24 h内基本稳定。

2.8 加样回收率试验 取同一批号的复方鱼腥草颗粒(140515)1袋(6 g)，研细，分为6份，每份约0.5 g，精密称定，分别置于100 mL的具塞锥形瓶中，再分别精密加入“2.2.1”项下的黄芩苷对照品溶液8 mL及黄芩素对照品溶液2 mL，然后精密吸入70%甲醇溶液40 mL，称定质量，超声20 min后，用70%甲醇溶液补足质量，过滤，滤液过0.45 μm微孔滤膜，得到的滤液为样品溶液，将制得的6份样品溶液按照“2.1”项下的色谱条件进行分析。计算得黄芩苷和黄芩素的平均回收率分别为99.52%、102.68%，表明方法的回收率良好。见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.9 检测限和定量限 逐步稀释黄芩苷和黄芩素混合对照品溶液，以信噪比为3∶1确定其最低检测限，黄芩苷和黄芩素最低检测限分别为0.374、0.605 μg/mL。以信噪比为10∶1确定其最低定量限，黄芩苷和黄芩素最低定量限分别为0.897、1.512 μg/mL。

2.10 样品的含量测定 取3批复方鱼腥草颗粒(批号分别为140403、140515、140711)各6 g，每批取2份，每份精密称定1 g，按照“2.2.3”项下的供试品制备方法制备供试品溶液，再按照“2.1”项下的色谱条件进行分析，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，记录色谱峰面积，按照外标一点法计算出复方鱼腥草颗粒中黄芩苷和黄芩素含量。结果3批样品中黄芩苷的平均含量分别为8.486 1、8.516 55、8.443 2 mg/g，RSD分别为0.640 7%、0.181 3%、0.775 5%；黄芩素的平均含量分别为0.495 15、0.473 85、0.479 8 mg/g，RSD分别为0.848 3%、0.698 3%、0.299 8%。结果表明，3批药品中黄芩苷和黄芩素的含量差别较小且其RSD均小于3%，说明不同批号的复方鱼腥草颗粒的质量相差不大。

3 讨论

3.1 测定波长的选择 取黄芩苷和黄芩素的混合对照品溶液，采用DAD在190～400 nm内全波长扫描，结果发现黄芩苷和黄芩素在274 nm处均有吸收，且共同吸收最大，同时可排除杂质对待测物的干扰，所以选择274 nm为本实验的检测波长。

3.2 流动相的选择 高效液相色谱法测定黄芩苷和黄芩素的含量时，流动相组成主要有乙腈-0.1%甲酸水溶液[11]、乙腈-0.1%冰醋酸溶液[12]、甲醇-0.4%磷酸溶液[13]、甲醇-0.1%磷酸溶液[14-15]等。所以采用不同比例的甲醇-水系统，甲醇-甲酸水系统，甲醇-磷酸系统，乙腈-水系统，乙腈-甲酸水系统和乙腈-磷酸系统进行流动相的考察。结果发现，流动相中加入一定比例的酸有助于提高待测物与干扰峰的分离度，且由于磷酸对色谱柱会有损伤，所以最终选择了乙腈-甲酸水系统。再通过对甲酸的浓度考察，最终选用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

流动相选定后，通过将一定比例(乙腈-甲酸水(30∶70))洗脱和各种梯度洗脱的结果进行对比，结果以乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)为流动相，线性梯度洗脱为：0～15 min，28% A；15～16 min，28%～45% A；16～40 min，45% A；40～41 min，45%～28% A；41～45 min，28% A时，洗脱效果最佳。

3.3 提取工艺的选择

3.3.1 提取溶剂的选择 虽然黄芩苷为苷类化合物，但其与黄芩素均含有大π苯环结构，故水溶性不是很好。为了更好地提取黄芩苷和黄芩素，本实验决定采用有机溶剂提取。许扬彪[16]在复方鱼腥草颗粒的质量标准研究中用70%的乙醇溶液作为提取溶剂；而余星云等[17]在复方鱼腥草滴丸中黄芩苷的含量测定研究中以甲醇为溶剂制备供试品溶液。故本实验采用50%甲醇溶液、70%甲醇溶液、100%甲醇溶液、50%乙醇溶液、70%乙醇溶液和100%乙醇溶液为溶剂，用超声10 min的方法提取复方鱼腥草颗粒，结果显示70%甲醇溶液提取得到的黄芩苷和黄芩素的含量最高，分别为10.057 6、0.554 4 mg/g。

3.3.2 提取方法的选择 黄芩苷和黄芩素的提取方法主要有煎煮法[18]、水提酸沉法[19]、回流提取法[20]、超声提取法[21]等，由于本次实验选择的溶剂为50 mL 70%甲醇溶液，故通过10、20、30 min超声提取及10、20、30 min回流提取的实验结果相比较，发现20 min超声提取黄芩苷和黄芩素的效果最好。在此条件下，得到的黄芩苷和黄芩素的含量分别为10.1850、0.518 2 mg/g。

3.3.3 样品称样量的选择 在选定提取方法为50 mL 70%甲醇溶液超声20 min后，就称样量对含量测定的影响做了研究。实验分别称取了0.5、1.0、1.5 g的复方鱼腥草颗粒做平行试验，结果黄芩苷的含量分别为9.183 7、10.185 0、9.693 9 mg/g；黄芩素的含量分别为0.475 9、0.518 2、0.524 1 mg/g。因此，尽管称取1.5 g复方鱼腥草颗粒样品时，黄芩素的含量最高，但当复方鱼腥草颗粒的称样量为1.0 g时，黄芩苷的含量最高，且黄芩素的含量也与1.5 g样品时相差很少，故选择1.0 g为药品的称样量。

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Determination of Baicalin and Baicalein in Compound Yuxingcao Granule by High-performance Liquid Chromatography

KUANG Zhao

(Yangzhou Center for Food and Drug Control, Jiangsu Yangzhou 225009, China)

Objective To establish a method for simultaneous determination of baicalin and baicalein in compound Yuxingcao Granule. Methods High-performance liquid chromatography (HPLC) was performed on a Thermo-C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) with a mobile phase of acetonitrile-0.1% formic acid for gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min, a sample size of 10 μL, a detection wavelength of 274 nm, and a column temperature of 25 ℃. Results The chromatographic analysis of baicalin and baicalein was completed within 30 minutes. Baicalin and baicalein showed a good linear relationship within the ranges of 0.069-0.34 mg/mL(r=0.999 8) and 0.005-0.025 mg/mL (r=0.999 4), respectively, with average recovery rates of 99.5% (RSD=3.33%) and 102.7% (RSD=2.44%), respectively. Conclusion The HPLC method established is quick, accurate, and convenient and has good repeatability. Therefore, it can be used for quality control of compound Yuxingcao Granule.

Compound Yuxingcao Granule; Baicalin; Baicalein; High-performance liquid chromatography

匡钊(1990-)，男，药师

R284.1

10.3969/j.issn.2095-7246.2016.06.024

2016-06-28；编辑：姚实林)