NMDA干预下Rab30在PC12细胞中的表达及凋亡通路

朱慧果，严 利，王 佳

(湖南省人民医院湖南省老年医学研究所，中国 长沙 410016)



NMDA干预下Rab30在PC12细胞中的表达及凋亡通路

朱慧果，严 利，王 佳*

(湖南省人民医院湖南省老年医学研究所，中国 长沙 410016)

探讨兴奋毒性氨基酸(NMDA)损伤干预下Rab30在PC12细胞中的表达及其凋亡通路，发现NMDA干预可能通过下调Rab30和GM130的表达，使高尔基体结构破裂成片，并可能通过上调GAAP和Caspase-3的表达，诱导PC12细胞的凋亡和死亡.

PC12细胞；Rab30；神经退行性疾病；兴奋毒性氨基酸；凋亡

高尔基体(Golgi apparatus，GA)在神经退行性疾病病理条件下和各种损伤机制(兴奋毒性氨基酸、钙超载、炎症因子、氧自由基等)下会出现应激反应，其结构发生变化，甚至发生碎裂[1-3].Rab30作为一种重要的调节型的运输蛋白，参与维持非神经细胞高尔基体结构完整[4]，可能参与损伤机制下神经细胞高尔基体碎裂的调控，从而导致神经元丧失.本研究对PC12细胞进行兴奋氨基酸毒性(NMDA)损伤干预，并借助细胞培养技术、MTT法检测PC12细胞存活率、Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡、Western-blot法检测目的蛋白表达情况等实验技术，从细胞及分子水平研究NMDA干预下Rab30在PC12细胞中的表达并探讨其凋亡通路.本研究希望为神经退行性疾病的病因及病理机制提供理论和实践依据，进而为神经退行性疾病药物治疗提供新的靶点.

1 实验材料与试剂

PC12细胞株(购自中国科学院上海细胞生物研究所)；1640培养基(Hyclone)，胎牛血清和胰酶消化液(Gibco)，青-链霉素溶液(碧云天)，NMDA 和MTT(Sigma)，Rab30(ORIGENE)，GAAP和GM130(Proteintech)，Caspase-3(CST)，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡(长沙维尔生物有限公司)，BCA蛋白定量试剂盒(Wellbio)，HRP goat anti-mouse IgG(Proteintech)，HRP goat anti-rabbit IgG(Proteintech)，Super ECL Plus 超敏发光液(Thermo pierce)，显影液和定影液(WellBiology).

2 实验方法

2.1 细胞培养

PC12细胞株用完全培养基(含胎牛血清10%和1640培养液90%及100 U/mL 青-链霉素混合液)，pH值调至7.2～7.4, 于37 ℃下，5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，1～2天换液，待PC12细胞生长汇合率达80%左右，用0.05%胰蛋白酶消化，一分为二传代，取对数生长期的细胞进行实验研究.

药物浓度配制及实验分组：将25 mg NMDA溶于1 mL DMSO溶液中，储液浓度为169.9 mmol/L.取2.9 μL加入到10 mL完全培养基中，终浓度为50 μmol/L.PC12细胞分别经正常情况下培养5 h(正常组)、加入50 μmol/L NMDA培养5 h(NMDA组)后进行以下实验.

2.2 检测细胞存活率

采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率，待细胞长至70～80%时，取出96孔板，吸去旧的培养基，分别加入上述已配制好的含药培养基，设正常组和50 μmol/L NMDA组，每组设3个复孔.处理5 h后，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，37 ℃下，5%CO2饱和湿度培养箱中培养4 h后取出，弃上清，每孔中加入150 μL二甲基亚砜，完全溶解后用酶联免疫检测仪在490 nm处测定其吸光度A，计算PC12细胞的存活率.

2.3 检测细胞凋亡率

按照Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒(KGA108)说明书检测PC12细胞凋亡率.正常组和NMDA组各处理5 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶进行消化，以冰冷PBS洗涤2次，离心(2 000 r/min，5 min)后收集约(1～5)×105细胞.除去上清液，滴入500 μL Binding buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI使用液使其混匀，置于室温下避光5～15 min后，1 h内采用流式细胞仪检测其荧光强度.采用专业软件Cell Quest对所得数据进行收集、储存和分析.

2.4 Western blot蛋白印迹法检测各目的蛋白在PC12细胞中的表达

将孵育好的PC12细胞分正常组、NMDA组，用预冷的PBS洗涤，离心(3 000 r/min，2 min)，吸除上清液.加入50 μL RIPA裂解液混匀；冰上蛋白裂解约30 min后用离心机离心(4 ℃,12 000 r/min，15 min)，取离心后的上清液进行蛋白浓度检测.按照BCA蛋白定量试剂盒(Wellbio)说明书进行操作，将蛋白经过电泳，将Rab30(23 k),GM130(130 k),GAAP(30 k),Caspase-3(32 k),β-actin(42 k)切片转膜，浸入封闭液中1 h.用1*TBST将一抗按照一定比例稀释(具体比例见表1)，将膜与一抗一起孵育，4 ℃过夜.用1*TBST稀释HRP标记的二抗(Proteintech)，稀释比例为1∶3 000，将膜与稀释后的二抗一同孵育40～60 min.用ECL显色曝光，将曝光后的底片扫描，并用Quantity one专业灰度分析软件进行分析.

预制装配式混凝土结构有多种形式，如剪力墙结构，框架结构，框架剪力墙结构和部分框架剪力墙结构。由于预制装配式结构的预制构件全部通过连接节点连接，所以混凝土结构在大范围内尚未广泛使用。与传统建筑方法相比，预制建筑物具有更多的连接界面和接缝，而装配式混凝土结构中的节点是装配式建筑的薄弱环节，在连接节点的处理问题上，国内的技术手段目前并不是很成熟。但装配式建筑结构在环保、节能和施工上与现浇相比优点比较突出。

表1 各种抗体的货源、货号及稀释比例表

2.5 统计学处理

3 实验结果

3.1 MTT比色法检测PC12细胞存活率比较

由表2可知，经损伤干预后各组的吸光度明显低于正常组(P<0.05).NMDA组吸光度A为0.149 7±0.035 7，与正常组0.257 2±0.009 3相比明显减少，差别有统计学意义(P<0.05).

表2 MTT法检测PC12细胞存活率各损伤干预组与正常组的比较

注：a与正常组比较，均P<0.05.

3.2 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率结果

注：*与正常组早期凋亡率比较，P<0.05；▲与正常组总凋亡率比较，P<0.05 图1 Annexin V-FITC/PI法检测各损伤干预组与正常组PC12细胞凋亡率比较 Fig.1 The apoptosis rate comparison of PC12 cell between the intervention group and the control group with Annexin V-FITC/PI method

由表3、图1和图2可知，正常活的PC12细胞(双阴性细胞)主要分布在流式细胞分析图中的左下象限，Annexin V-FITC及 PI均低染(Annexin V-PI-)；早期凋亡的细胞或死亡的细胞分布在流式分析图的右下象限，Annexin V-FITC高染而 PI低染(Annexin V+PI-)；晚期死亡或凋亡的细胞分布在图的右上象限，Annexin V-FITC及PI均高染(Annexin V+PI+)[5].结果显示未经损伤干预的正常组PC12细胞绝大部分均为双阴性细胞(图2A，左下象限)，约占99.15%；正常组细胞结构完整,无明显细胞凋亡或死亡；而经损伤干预后两组细胞的凋亡率明显增加，NMDA组的早期凋亡率及总凋亡率与正常组比较显著增加,差异有统计学意义(P<0.05).

表3 Annexin V/PI双染法检测PC12细胞的凋亡率比较

注：a与正常组的早期凋亡率比较，P<0.05；b与正常组的总凋亡率比较，P<0.05.

A：正常组 B：NMDA组图2 Annexin V-FITC/PI法检测PC12细胞的凋亡率Fig.2 The apoptosis rate of PC12 cells detected by Annexin V-FITC/PI method

3.3 Western blot法检测目的蛋白在PC12细胞中的表达情况

由图3和图4可知，经损伤处理后NMPA组中的GAAP和Caspase-3在PC12细胞中表达较正常组的显著增加，Rab30和GM130较正常组的表达下降.Rab30在NMDA组中的蛋白表达(0.127 6±0.002 4)与正常组(0.227 2±0.002 0)比较，差异有统计学意义(P<0.05)； GM130在NMDA组中的蛋白表达(0.181 1±0.004 1)与正常组(0.270 4±0.005 3)比较，差异有统计学意义(P<0.05)；GAAP在NMDA组中的蛋白表达(0.562 5±0.016 4)与正常组(0.284 2±0.004 2)比较，均P<0.05，有统计学意义；Caspase-3在NMDA组中的蛋白表达(0.573 2±0.001 9)与正常组(0.323 2±0.000 6)比较，差别有统计学意义(P<0.05).

注：*，#，★，◆，与正常组比较，P<0.05.图3 损伤干预组与正常组各目的蛋白相对表达水平比较Fig.3 The comparison of the relative expression level of target protein between the intervention group and the normal group

A：正常组；B：NMDA组图4 蛋白免疫印迹法检测Rab30， GM130， GAAP和Caspase-3的表达情况Fig.4 The expression of GAAP, GM130, Caspase-3 and Rab30 by Western blot

4 讨论

神经退行性疾病是脑细胞和脊髓细胞中的神经元丧失的一种疾病状态，兴奋性氨基酸在神经退行性疾病中起着非常重要的作用.当神经细胞受到兴奋性氨基酸毒性作用后，可引起细胞内钙离子超载，产生大量的活性氧物质，最终导致神经元死亡[6-7].本研究结果发现PC12细胞株经NMDA处理后，PC12细胞的存活率减少，凋亡率增加，GAAP和Caspase-3蛋白量表达增加.NMDA很可能是通过增加胞内 Ca2+浓度，使钙离子稳态失衡，进而导致PC12细胞死亡.

神经退行性疾病的本质是神经元的丧失，高尔基体的形态改变或破裂是神经退行性疾病共同出现的特征.一旦高尔基体的结构及功能遭受破坏，将会导致蛋白质、脂质结构和转运的异常，神经元细胞功能紊乱，最终导致疾病的发生[8-9].Rab蛋白是一类小分子调节型GTP结合蛋白(small GTP-binding proteins)，最近的研究表明Rab30主要定位于高尔基体中，并且在非神经细胞中维持高尔基体结构完整，Rab30的沉默表达可导致正常高尔基体弓形结构破裂成片[2].在笔者研究中发现，Rab30经NMDA损伤干预后在PC12细胞中的表达下调，因此，笔者推断Rab30很可能参与损伤干预下神经细胞中高尔基体破裂的调控作用，但具体如何调控还需进一步研究.

高尔基体基质蛋白130(Golgi matrix protein 130，GM130) 是高尔基体顺面网状结构中一个重要的基质蛋白，可作为高尔基体结构定位的标记物，GM130表达量下降可作为高尔基体破坏比较敏感的分子标志[10-11].本研究中经药物处理后的PC12细胞存活率减少，凋亡率增加，GM130相对表达量较正常组明显下降.因此，笔者推断NMDA损伤干预很可能通过下调GM130的表达来影响高尔基体的形态及结构，诱导PC12细胞死亡.

有研究证明高尔基体抗凋亡蛋白(Golgi anti-apoptotic protein，GAAP)主要定位在高尔基体上[12-13].本实验发现经损伤处理后GAAP蛋白表达量较正常组明显增加，因此笔者推断GAAP的高表达很可能是因PC12细胞经损伤干预后，在应激状态下做出应答，通过高表达可延缓高尔基体结构的破裂，但抗凋亡蛋白仍不足以抵抗各种损伤，最终出现了PC12细胞的凋亡或死亡.目前对GAAP这种最新发现的蛋白研究不多，GAAP蛋白的高表达与PC12细胞凋亡具体机制及相互关系还需进一步探讨.

天冬氨酸特异性酶半胱氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate-specific protease, Caspase-3)是细胞凋亡的关键蛋白酶及执行者[14-15].在本研究中，经损伤干预后PC12的凋亡率明显增加，Caspase-3蛋白表达量亦明显增加.Caspase-3是神经元凋亡的易感因子，兴奋氨基酸毒性可导致Caspase-3被激活，最终导致神经元的损伤.因此，NMDA损伤干预很可能是通过调控凋亡蛋白Caspase-3的表达，诱导PC12细胞的死亡，故研究Caspase-3的抑制剂或抑制其活性，可在一定程度上减缓或阻止神经退行性疾病的进程.

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(编辑 WJ)

The Expression and Apoptosis Pathway of Rab30 in PC12 Cells Under NMDA Interventions

ZHUHui-guo,YANLi,WANGJia*

(Hunan Institute of Gerontology, Hunan Provincial People’s Hospital, Changsha 410016, China)

In this work, we report a study of the expression and apoptosis pathway of Rab30 in PC12 cells under injury interventions of NMDA. Our results show that NMDA interventions are likely to break the structure of golgi into pieces through downgrading the expression of Rab30 and GM130, leading to the induction of the apoptosis of PC12 cells through adjusting the expression of GAAP and Caspase-3.

PC12 cells; Rab30; neurode-generative diseases; NMDA; apoptosis

10.7612/j.issn.1000-2537.2016.06.006

2016-09-01

湖南省自然科学基金资助项目(14JJ2143)；湖南省卫计委计划资助项目(B2012-121)

Q189

A

1000-2537(2016)06-0032-05

*通讯作者,E-mail：13875888342@163.com