中药穴位敷贴对实验性乳腺增生模型大鼠雌、孕激素受体表达的影响

白东艳，易玮，李艳慧，王澍欣，刘畅，廖穆熙

（1.广州中医药大学针灸康复临床医学院，广东广州510405；2.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州510405）

中药穴位敷贴对实验性乳腺增生模型大鼠雌、孕激素受体表达的影响

白东艳1，易玮1，李艳慧2，王澍欣2，刘畅1，廖穆熙2

（1.广州中医药大学针灸康复临床医学院，广东广州510405；2.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州510405）

【目的】探讨中药穴位敷贴疗法对实验性乳腺增生模型大鼠的作用机制。【方法】将30只SD（远交群）大鼠随机分为正常组、模型组、穴位敷贴组，每组10只。采用雌激素诱导法复制大鼠实验性乳腺增生模型，以中药穴位敷贴治疗。采用免疫组织化学染色方法，观察各组大鼠乳腺组织细胞中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）的分布或含量。【结果】与正常组比较，模型组ER、PR表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，穴位敷贴组ER、PR表达水平显著降低（P＜0.01）。【结论】中药穴位敷贴疗法可能通过下调乳腺组织ER、PR表达，从而起到抑制乳腺增生的作用。

乳腺增生；中药穴位敷贴；雌激素受体；孕激素受体；疾病模型，动物；大鼠

乳腺增生属中医“乳癖”范畴。中药穴位敷贴疗法属中医外治法，是以中医理论为指导，应用中草药制剂施于腧穴的治病方法。经临床验证，中药穴位敷贴疗法用于乳腺增生病治疗，疗效确切[1-2]。为进一步探讨中药穴位敷贴治疗乳腺增生的作用机理，本研究拟观察其对实验性乳腺增生模型大鼠雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）表达的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD大鼠30只，清洁级，雌性，未孕，体质量（200±20）g，鼠龄3个月，由广州中医药大学动物实验中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2003-001。

1.2 试剂与仪器己烯雌酚注射液，由上海通用药业股份有限公司出品，国药准字H31021403，批号：050101；黄体酮注射液，广州明兴制药厂出品，国药准字H31021401，批号：041102；ER抗体（BA0345，兔多抗，1∶100）、PR抗体（BA0107，兔多抗，1∶100）、磷酸盐缓冲液（PBS）、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒，均由武汉博士德生物工程有限公司提供。BMK-D500型数码光学显微镜，由重庆奥特光学有限公司生产。

1.3 实验药物穴位敷贴药物由本课题组自制。将冰片与三棱、莪术、天南星按质量比1∶3∶3∶3研成粉末，加甘油调成糊状，制成膏，恒温保存，待用。

1.4 实验分组及造模将大鼠按体质量随机分为3组（N=10）：正常组、模型组、穴位敷贴组，苦味酸标记。常规喂养，适应性喂养1周后造模。正常组每天注射生理盐水0.2 mL/只，连续30 d。其他2组参考黄月玲等[3]的造模方法，在大鼠大腿内侧肌肉注射己烯雌酚注射液0.5 mg·kg-1·d-1，连续25 d后，改用肌肉注射黄体酮注射液4 mg·kg-1·d-1，连续5 d。

1.5 干预方法造模成功后，正常组和模型组以蒸馏水灌胃，2 mL/次，每天1次，连续28 d。穴位敷贴组每天给予穴位敷贴治疗6～8 h，连续28 d，具体方法：应用硫化钡将大鼠中下腹部（相当于关元、气海穴）脱毛，脱毛面积约为2 cm×4 cm，将大小约1 cm×1 cm、厚0.5 cm的药膏，以纱布做衬，用胶布敷贴固定于气海、关元穴及乳房局部阿是穴上。3组大鼠均予同等条件喂养，实验结束后处死。

1.6 标本采集及指标观察处死大鼠后，取乳腺组织，以体积分数为10%的甲醛固定液固定，石蜡包埋，切片。采用免疫组织化学染色方法，观察各组大鼠乳腺组织细胞中ER、PR分布和阳性表达强度。

免疫组织化学反应结果判定标准：参照文献[4]。乳腺组织细胞核内出现棕色颗粒的细胞即为ER或PR阳性表达细胞。高倍镜下每例随机选取10个视野，共计数1 000个细胞，计算得出阳性细胞所占百分数。根据显色强度和阳性细胞数2项指标来综合判定ER或PR阳性表达强度：显色浅、阳性细胞数＜25%者为“+”；显色较浅、阳性细胞数介于25%～50%者为“++”；显色较深、阳性细胞数介于50%～75%者为“+++”；显色深、阳性细胞数＞75%者为“++++”。并将+、++、++++、++++、分别计为1、2、3、4分。

1.7 统计方法应用SPSS 19.0统计软件进行数据处理。3组ER、PR蛋白表达强度比较，采用Kruskal Wallis秩和检验，若组间差异有统计学意义，则采用两独立样本的秩和检验进行组间两两比较。3组ER、PR蛋白表达强度计分均值以均数±标准差表示，组间经K-S检验，服从正态分布，经Levene检验，若方差齐，采用方差分析，若组间差异有统计学意义，应用LSD法进行两两比较；方差不齐，采用Dunnett’s T3法。

2 结果

图1～2结果显示：正常组乳腺腺泡上皮仅有少量细胞核呈棕色着色；模型组增生的腺泡上皮细胞核着色加深；穴位敷贴组腺泡上皮细胞核着色较模型组变浅。

表1结果显示：正常组ER、PR阳性表达强度多在+～++，模型组多在+++～++++，穴位敷贴组多在++～+++。模型组ER、PR阳性表达强度与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；穴位敷贴组ER表达与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而穴位敷贴组PR表达与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表2结果显示：与正常组比较，模型组ER、PR表达升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，穴位敷贴组ER、PR表达降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 各组大鼠乳腺组织ER表达（免疫组织化学法，×200）Figure 1Comparison of ER expression in rat mammary gland tissues of various groups（by immunohistochemistry，×200）

图2 各组大鼠乳腺组织PR表达（免疫组织化学法，×200）Figure 2Comparison of PR expression in rat mammary gland tissues of various groups（by immunohistochemistry，×200）

表1 各组大鼠乳腺组织ER、PR蛋白表达强度比较Table 1Comparison of ER and PR expression intensity in rat mammary gland tissues of various groupsn/例

3 讨论

3.1 穴位敷贴药物处方及选穴依据

敷贴药物选用天南星、三棱、莪术、冰片4种中药。天南星化痰散结、消肿止痛，外用善治痈疽、痰核肿痛；三棱、莪术功专破血行气、消积止痛；冰片辛香走窜，清热止痛，又能通诸窍、散郁结。四药外用，共奏行气活血、消积止痛之功。本研究参考靳三针疗法中“阳三针”的配穴方法，选用关元穴、气海穴及乳房局部阿是穴。关元穴、气海穴均为任脉之穴，任脉与女性生长发育和生殖关系密切。关元穴又为足三阴、足阳明、任脉的交会穴，主一身元气；气海穴为脐下“丹田”，“主一切气疾”，两穴可通调冲脉、任脉、足三阴经的气血，舒畅气机、培补元气。乳腺增生属本虚标实之证，以肝肾不足、冲任失调为本，气滞、痰凝、血瘀为标。本中药穴位敷贴法针对乳腺增生的病机特点，调冲任以固本培元，行气活血以消肿止痛，标本兼顾，已被证实运用于临床治疗乳腺增生病患者有良好的疗效[4]。本课题组既往研究[5]亦表明，穴位敷贴法干预乳腺增生模型大鼠后乳腺组织结构与模型组比较，乳腺导管上皮排列基本规则，导管管腔未见明显扩大。

表2 各组大鼠乳腺组织ER、PR蛋白表达强度计分Table 2 Comparison of ER and PR expression intensity scores in rat mammary gland tissues of various groups，s/分）

表2 各组大鼠乳腺组织ER、PR蛋白表达强度计分Table 2 Comparison of ER and PR expression intensity scores in rat mammary gland tissues of various groups，s/分）

①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.01，与模型组比较

组别正常组模型组穴位敷贴组N 10 10 10 ER 1.5±0.53 3.5±0.71①2.6±0.52②PR 1.5±0.53 3.7±0.42①2.4±0.70②

3.2 ER、PR与乳腺增生病

乳腺增生病属内分泌障碍性疾病。若雌激素分泌过多、孕激素相对减少，可导致乳腺组织在增生和复旧的周期性过程中发生病理性改变，引起乳腺末梢导管上皮呈不规则增生、导管扩张和囊肿形成，发生乳腺实质增生[6]。ER、PR是可以与雌激素、孕激素特异性结合的蛋白质，雌、孕激素的水平是否正常直接影响ER、PR的表达情况。病理状态时，雌二醇（E2）与细胞内ER亚型ERα结合后激活转录，促使乳腺细胞线粒体数量显著增多[7]。当乳腺细胞线粒体过度表达时，自身功能障碍随之产生[8]，可诱导乳腺上皮及间质纤维增生[9]，降低细胞自身修复能力，还可促进ER和PR的合成，使乳腺上皮对雌激素的敏感性增加[10]。另外，E2和ER异常升高时，可引起PR亚型PR-A过度表达，使乳腺组织增生细胞的黏附力下降，诱导乳腺细胞发生形态改变；PR-A可激活特异性生长因子，致使乳腺上皮细胞对孕激素应答紊乱，不能由增殖转入复旧[11]。研究表明，正常乳腺导管和小叶上皮细胞存在ER和PR，其数量因乳腺分化程度而异；良性乳腺疾病的肿块组织ER和PR阳性率高于正常组织，但低于恶性肿瘤[12]。研究[12]表明，临床患者乳腺增生病理组织中ER、PR呈高表达；SD大鼠乳腺增生模型研究结果发现模型组ER、PR阳性强度及表达数量随乳腺增生程度加重而增加[9]。

本研究结果显示，大鼠乳腺组织增生程度越明显，其ER及PR积分值也越高，ER、PR表达也越强，与临床试验病理结果[13]一致。中药穴位敷贴疗法能抑制雌激素过度刺激所致的大鼠乳腺上皮增生，其机制可能是通过降低乳腺组织ER、PR含量，使乳腺组织对雌激素的敏感性下降，从而减弱雌激素在靶细胞上的生物学效应，产生抑制和治疗乳腺增生作用。提示按照受体—受体病—受体调控模式，研究中医药对乳腺增生病的干预机制，针对性更强，更有利于提高临床研究效能。

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［4］许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准［J］.中国癌症杂志，1996，6（4）：230.

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［12］安凤玲，李永茂.乳腺增生病的性激素受体表达及临床意义［J］.实用医技杂志，2007，14（4）：426.

［13］龚东方，陆智华，邝幸华.针刺和中药对乳腺增生的抑制作用研究［J］.广州中医药大学学报，2003，20（3）：216.

【责任编辑：黄玲，侯丽颖】

Effect of Chinese Medicine Point Application on Estrogen Receptor and Progesterone Receptor Expression in Experimental Rat Model with Hyperplasia of Mammary Glands

BAI Dongyan1，YI Wei1，LI Yanhui2，WANG Shuxin2，LIU Chang1，LIAO Muxi2
（1.Clinical Medical College ofAcupuncture，Moxibustion and Rehabilitation，Guangzhou UniversityofChinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China；2.The First Clinical Medical College，Guangzhou UniversityofChinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

ObjectiveTo explore the therapeutic mechanism of acupoint application of Chinese medicine for experimental rat model with hyperplasia of mammary glands.MethodsThirty Sprague Dawley rats were randomly divided into normal group，model group，and acupoint application group，10 rats in each group.Experimental model with hyperplasia of mammary glands was established by estrogen-induced method.The acupoint application of Chinese medicine was used for the treatment.The estrogen receptor（ER）and progesterone receptor（PR）expressionin mammary glands of various groups were determined by immunohistochemistry.ResultsCompared with the normal group，the levels of ER and PR expression were increased in the model group（P＜0.01）.Compared with the model group，the levels of ER and PR expression were decreased in the acupoint application group（P＜0.01）.ConclusionThe acupoint application of Chinese medicine has curative efficacy on hyperplasia of mammary glands，and its mechanism may be related with the down-regulation of ER and PR expression.

hyperplasia of mammary glands；Chinese medicine acupoint application；estrogen receptor（ER）；progesterone receptor（PR）；disease models，animal；rats

R285.5

A

1007-3213（2016）06-0827-04

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.06.017

2016-06-21

白东艳（1974－），女，副教授；E-mail：bdyan203@gzucm.edu.cn

易玮（1966-），女，教授；E-mail：yw8013@gzucm.edu.cn

广州中医药大学青年教师科研创新基金项目（编号：06c026）