Toll样受体-2、核因子-κB在Aβ诱导的阿尔茨海默病中的作用

狄婷婷 张 美 王瑞婷 丁 实 刘永平

(承德医学院，河北 承德 067000)



Toll样受体-2、核因子-κB在Aβ诱导的阿尔茨海默病中的作用

狄婷婷1张 美 王瑞婷 丁 实 刘永平

(承德医学院，河北 承德 067000)

目的 探讨Toll样受体2(TLR-2)、核因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β与β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的阿尔茨海默病(AD)中的作用。方法 将雄性Wistar大鼠50只，随机分为A、B、C、D、E组，每组10只；A组大鼠双侧海马CA1区注射5 μl生理盐水，B～E组双侧海马注射5 μl Aβ(分别含Aβ25～350.5、1、5、10 μg)；ELISA检测TNF-α、IL-1β含量；免疫组化(IHC)检测海马CA1区TLR-2表达；实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测TLR-2、NF-κB基因的mRNA表达。结果 IHC检测TLR-2主要聚集在Aβ斑块周围，D组(0.036 6±0.007 3)、E组(0.044 8±0.010 8)TLR-2阳性表达明显高于A组(0.018 7±0.005 8)、B组(0.010 0±0.003 4)、C组(0.015 1±0.006 0)(P<0.01)；ELISA检测大鼠血清TNF-α含量D组(568.65±44.66)pg/ml、E组(685.06±29.92)pg/ml明显高于A组(426.87±55.91)pg/ml、B组(432.99±28.09)pg/ml、C组(488.14±39.04)pg/ml(P<0.01)，IL-1β含量D(104.60±9.32)pg/ml、E组(143.38±17.09)pg/ml明显高于A(49.13±8.46)pg/ml、B(60.89±14.71)pg/ml、C(79.81±9.94)pg/ml三组(P<0.01)；qRT-PCR检测大鼠海马组织内TLR-2 mRNA表达D组(2.185 9±0.381 4)、E组(2.977 7±0.390 7)明显高于A组(1.000 0±0.000 0)、B组(1.178 5±0.106 6)、C组(1.463 3±0.127 3)(P<0.01)；NF-κB mRNA表达D组(1.747 0±0.125 6)、E组(2.271 9±0.533 2)明显高于A组(1.000 0±0.000 0)、B组(1.274 3±0.165 1)、C组(1.429 1±0.077 7)(P<0.01)。结论 随着Aβ剂量不断增加，TLR-2促进小胶质细胞吞噬和清除Aβ的能力不足使Aβ积聚体并激活NF-κB，促进更多的TNF-α、IL-1β释放，最终导致大鼠脑内神经元损伤。

β淀粉样蛋白；Toll样受体2；核因子-κB；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-1β

阿尔茨海默病(AD)发病机制十分复杂〔1〕。β-淀粉样蛋白(Aβ)作为AD发病的始动因子已得到公认〔2〕。神经细胞外老年斑(SP)形成是AD最具特征性的病理改变，主要由Aβ沉积而成〔3〕，在SP周围有大量活化的小胶质细胞(MG)和炎性因子存在〔4,5〕。有研究认为，MG是AD脑内炎性反应中最重要的炎性细胞，介导AD病理发展的全过程。Toll样受体(TLR)是MG表达的最主要受体,核因子(NF)-κB是一类重要的转录因子，两者在MG介导的Aβ摄取和清除以及MG激活的过程中都起到至关重要的作用。AD脑内TLR-2、NF-κB的表达是否与Aβ的量有关，血清中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β含量是否会受到影响，成为MG在AD炎症机制的研究热点。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂 江湾1型C脑立体定位仪；Excelsior ES全自动组织脱水机；Z-BJ0010包埋聚合器；RM2125型石蜡切片机；CK40-F200相差倒置显微镜；Olympus显微镜摄像装置；DU80型紫外分光光度计；Mx3000P型实时荧光定量PCR仪。Aβ25～35(A4559，Lot:112M4775V)购自美国Sigma-Aldrich有限公司，HPLC检测纯度≥97%；通用型SP工作液SP-9001免疫组化染色试剂盒(Lot:14188A)、辣根过氧化物酶DAB显色试剂盒(ZLI-9017,Lot:K136620C)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；TLR-2抗体(3268-S,Lot:YJ031901DS2)购自美国Epitomics公司；实时荧光定量PCR试剂盒(RR820A,Lot:AK4505)、RNAiso Plus(9108Q,Lot:AK7602)、DEPC水(9013A,Lot:AA1801A)、反转录试剂盒(RR047A,Lot:AK3701)，购自大连宝生物工程有限公司；大鼠血清TNF-α(EK3822,Lot:238231215)、IL-1β(EK301B2,Lot:2301B30241)ELISA试剂盒购自联科生物技术有限公司；其他试剂为分析纯。Aβ25～351 mg干粉溶于500 μl无菌生理盐水(2 g/L)，-20℃保存，临用前置于37℃孵育5～7 d成凝胶态。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理方法 Wistar大鼠，50只，成年雄性，10～12周龄，体重(250±20)g，SPF级，动物证号No.11400700022071，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供〔许可证号：SCXK(京)2012-0001〕。随机分为5组，编号A、B、C、D、E，每组10只。A组大鼠双侧海马CA1区注射5 μl生理盐水，B～E组双侧海马注射5 μl Aβ(分别含Aβ25～350.5、1、5、10 μg)。大鼠麻醉后，将其固定在江湾1型C脑立体定位仪上，参照大鼠脑立体定位图谱进行脑立体定位海马CA1区，即前囟后(AP-)3.50 mm，中缝左或右(ML±)2.00 mm，颅骨硬脑膜平面向下(DV)2.70 mm，用微量注射器给Aβ，留针5 min，缓慢拔针，牙托粉封固颅骨孔，缝合皮肤伤口，术后注射青霉素抗感染，1次/d，10万U/次，连用3 d〔6〕。于注射Aβ 14 d后处死，取血和脑组织标本。

1.2.2 IHC检测TLR-2表达 每组取4只大鼠脑组织制作标本后，每个标本选取海马CA1区细胞损伤段2张石蜡切片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精水合等步骤，滴加TLR-2Ⅰ抗(1∶500)，用PBS液代替Ⅰ抗作为阴性对照。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，计算每组切片的光密度平均值。

1.2.3 qRT-PCR技术检测TLR-2、NF-κB mRNA表达水平 每组取6只大鼠，麻醉后，迅速取新鲜脑海马组织暂存于超低温冰箱(-80℃)。采用Trizol法提取总RNA；紫外分光光度计检测RNA的纯度；根据RNA纯度检测结果计算应加入RNA样品的使用量，按大连宝生物工程有限公司提供的反转试剂盒说明书于冰上将总RNA逆转录合成cDNA；以β-actin为内参照，在GenBank数据库内分别查找TLR-2、NF-κB的基因序列，引物由TaKaRa生物技术有限公司设计并合成。β-actin：正义链：5'-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3'，反义链：5'-TAGAGCCACCAATCCACACA-3'，NF-κB：正义链：5'-ACGATGGGACGACACCTCTA-3'，反义链：5'-TAACTTCTGCGCCAGAGTGG-3'，TLR-2：正义链：5'-TGGAGTCCAGCGGAATCAAC-3'，反义链：5'-CAGGAAAGCAGACTCGCTCA-3'。根据大连宝生物工程有限公司提供的实时荧光定量PCR试剂盒说明书，配制25 μl总反应体系，反应条件：预变性95℃ 30 s，变性95℃ 5 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，40个反应循环数，实时荧光定量PCR仪检测各组大鼠脑组织中TLR-2、NF-κB基因mRNA表达的水平，记录CT值，利用2-ΔΔCt的方法分析。

1.2.4 ELISA法检测TNF-α、IL-1β含量 检测程序严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，在30 min之内用酶标仪450 nm波长测定光密度(OD)值，运用CurveExpert 1.4-Cvxpt32，绘制标准品拟合曲线，计算标本待测因子含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析及q检验。

2 结 果

2.1 IHC检测海马CA1区MG上的TLR-2表达结果 IHC检测，400倍视野光镜下可见TLR-2阳性表达为棕黄色颗粒物，主要聚集在Aβ斑块的周围，在MG上高表达。同时可见，A、B、C组大鼠海马CA1区均可见3～4层细胞，形态完整而清晰，有神经元的突起；而D、E组大鼠海马CA1区细胞层数明显减少，多为1～2层，剩余的细胞肿胀，其细胞核呈空泡状，并可见MG吞噬神经元现象。IHC检测结果显示，TLR-2阳性表达D组(0.036 6±0.007 3)、E组(0.044 8±0.010 8)明显高于A组(0.018 7±0.005 8)、B组(0.010 0±0.003 4)、C组(0.015 1±0.006 0)(P<0.01)，且A、B组间差别无统计学意义(P>0.05)，B、C组间差别无统计学意义(P>0.05)，A、C两组间差异显著(P<0.05)，D、E两组间差异显著(P<0.05)。见图1。

图1 大鼠海马CA1区TLR-2阳性表达(IHC，×400)

2.2 qRT-PCR法检测各组大鼠海马组织内TLR-2、NF-κB mRNA表达结果 各组TLR-2 mRNA表达：D组(2.185 9±0.381 4)、E组(2.977 7±0.390 7)明显高于A组(1.000 0±0.000 0)、B组(1.178 5±0.106 6)、C组(1.463 3±0.127 3)(P<0.01)，且A、B组间差别无统计学意义(P>0.05)，B、C组间差别无统计学意义(P>0.05)，A、C组间差异显著(P<0.05)，D、E组间差异显著(P<0.01)。NF-κB mRNA：D组(1.747 0±0.125 6)、E组(2.271 9±0.533 2)明显高于A组(1.000 0±0.000 0)、B组(1.274 3±0.165 1)、C组(1.429 1±0.077 7)(P<0.01)，且A、B组间差别无统计学意义(P>0.05)，B、C组间差别无统计学意义(P>0.05)，A、C组间差异显著(P<0.05)，D、E组间差异显著(P<0.01)。

2.3 ELISA法检测各组大鼠血清TNF-α和IL-1β水平 TNF-α含量：D组(568.65±44.66)pg/ml、E组(685.06±29.92)pg/ml明显高于A组(426.87±55.91)pg/ml、B组(432.99±28.09)pg/ml、C组(488.14±39.04)(P<0.01)，且A、B组间差别无统计学意义(P>0.05)，B、C组间差别无统计学意义(P>0.05)，A、C组间差异显著(P<0.05)，D、E组间差异显著(P<0.05)。IL-1β含量：D组(104.60±9.32)pg/ml、E组(143.38±17.09)pg/ml明显高于A组(49.13±8.46)pg/ml、B组(60.89±14.71)pg/ml、C组(79.81±9.94)pg/ml(P<0.01)，且C组与A组差异显著(P<0.01)，D、E组间差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

TLR是MG表达的最主要受体之一,其中TLR-2在MG介导的Aβ摄取和清除以及MG激活的过程中都起到至关重要的作用。Jana等〔7〕发现敲除TLR-2或利用抗体阻断等体内、外实验可减少Aβ诱导的促炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达及MG标志物表达，推测Aβ通过TLR-2受体激活MG，分泌促炎性因子，但Richard等〔8〕利用转基因TLR-2缺失小鼠发现小鼠学习记忆能力下降，并且Aβ水平升高，推测TLR-2激活参与了MG清除毒性Aβ，因此TLR-2可能同时介导对Aβ的清除和诱导炎症因子释放。本实验IHC及qRT-PCR检测结果均显示，D、E组TLR-2表达明显增高，并聚集在Aβ斑块周围。NF-κB是一类重要的转录调控因子，它在免疫反应与炎症刺激中会发挥非常重要的作用。有研究报道通过氧化应激信号转导通路，NF-κB的激活，促进前炎症因子IL-1β、TNF-α等的释放〔9〕。许多NF-κB依赖性基因，尤其是促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β在MG中均有表达，NF-κB活化是AD病变的重要机制。AD时NF-κB过度活化，介导脑内炎症反应的发生，进一步造成神经损伤〔10〕。本文结果也显示NF-κB表达与ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IL-1β含量一致。有研究报道TLR-2可激活NF-κB，诱发TNF-α、IL-1β释放〔11～13〕，本文实验结果进一步证实Aβ上调TLR-2、NF-κB表达，诱导炎症因子释放，损伤神经元。

综上，可推测Aβ被MG表面的TLR-2识别，激活MG，当Aβ剂量较低时，TLR-2促进MG对Aβ的吞噬和清除，并激活NF-κB，促进炎症因子如TNF-α、IL-1β等释放，但释放较少，不引起神经元损伤，还可能具有保护作用；随着Aβ剂量不断增加，当Aβ在脑内到达一定浓度时，作为一种炎性刺激因子，可诱导MG增殖、活化，并刺激神经毒性物质的表达，TLR-2促进MG吞噬和清除Aβ的能力不足以清除脑内过多得Aβ，进一步激活NF-κB，诱导基因转录，并通过反馈环路刺激MG分泌炎性细胞因子，如IL-1β、TNF-α等释放，导致炎症过程的持续放大，形成一个恶性循环，最终导致神经细胞损伤。

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〔2015-12-08修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

河北省教育厅重点资助课题(No.ZD20131051)；河北省高校重点学科资助项目(No.20130337)

1 承德护理职业学院

王瑞婷(1969-)，女，教授，博士，硕士生导师，主要从事阿尔茨海默病发病机制及中药抗痴呆作用研究。

狄婷婷(1981-)，女，副教授，硕士，主要从事阿尔茨海默病发病机制研究。

R749

A

1005-9202(2016)23-5780-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.005