家族型帕金森病α-突触核蛋白突变体寡聚化对神经元毒性的影响

王 鹏 历 春 王海鹏 盖晓东

(北华大学基础医学院人体解剖学教研室，吉林 吉林 132013)



家族型帕金森病α-突触核蛋白突变体寡聚化对神经元毒性的影响

王 鹏 历 春1王海鹏 盖晓东1

(北华大学基础医学院人体解剖学教研室，吉林 吉林 132013)

目的 观察家族型帕金森病(PD)α-突触核蛋白(α-Syn)突变体A53T和A30P聚集体对大鼠原代神经元的神经毒性。方法 取大鼠前脑皮质神经元进行原代培养，在培养基中加入体外孵育的α-Syn聚集体。培养14 d后，MTT法和神经元流式细胞术观察神经元的细胞活力。免疫荧光染色后以激光共聚焦显微镜观察细胞内聚集体的分布。硫磺素S染色观察细胞内包涵体的形成。结果 加入α-Syn聚集体各组的原代神经元细胞活力较对照组降低(P<0.05)，而加入突变体A53T和A30P聚集体的原代神经元细胞活力比对照组明显降低(P<0.01)；突变体A53T和A30P聚集体的原代神经元细胞活力下降较野生型α-Syn聚集体显著(P<0.05)。突变体A53T和A30P聚集体对神经元的毒性作用，在1～14 d内随培养时间而增加(P<0.05)；在1～10 μmol/L浓度范围内，随浓度的增加而毒性增加(P<0.05)。突变体A53T和A30P聚集体可以进入原代神经元内，并可在细胞内聚集而形成硫磺素S染色阳性的斑块。结论 家族型α-Syn突变体A53T和A30P聚集体对原代神经元具有神经毒性，此作用具有时间和剂量依赖关系。这一现象对阐明家族型PD的发病机制具有重要意义。

帕金森病；α-突触核蛋白；寡聚体；原代神经元；神经毒性

目前研究认为，老化、遗传和环境因素的相互作用是帕金森病(PD)发病的主要原因，而α-突触核蛋白(α-Syn)作为广泛存在的PD特征性病理变化——路易体(LB)的主要成分，被认为是引起PD发病的关键性蛋白。α-Syn在神经组织中表达丰富，正常情况下主要存在于神经元的突触前神经末梢，参与多巴胺代谢及突触可塑性调控等多种功能。通过对罕见的PD家系的研究，发现一种编码α-Syn基因的SNCA错义点突变(A53T、A30P、E46K、H50Q和G51D)可以直接引起家族性、早发性PD〔1，2〕。而聚集成纤维的α-Syn是LB的主要成分〔3〕。随后，人们还发现SNCA的二倍体和三倍体变异也可以直接引起家族性、早发性PD，而该基因启动子区的某些多态性则与散发性PD的发病风险相关。这些发现使人们相信α-Syn的异常聚集与PD的发病具有密切关系。体外研究结果表明，突变α-Syn比野生型α-Syn更容易发生错误折叠〔4〕，然而，家族型突变体α-Syn的异常聚集体对神经元有何种影响，是否具有比野生型α-Syn的聚集体更容易引起PD样病变尚不明确。本研究观察了家族型PD α-Syn突变体A53T和A30P聚集体对神经元的毒性，对家族型PD的发病机制提供了新的佐证。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 DMEM(F-12)细胞培养基，购自GIBCO公司；胎牛血清(FBS)和马血清(HS)，购自GIBCO公司。蛋白分子量Marker，购自Pharmacia。BCA蛋白质定量试剂盒BCA Protein Assay Kit，购自宝生物公司。MTT法细胞活力检测试剂盒，购自Promega公司。α-Syn单克隆抗体(ab138501)，购自Abcam公司。其他均为化学分析纯试剂。

1.2 实验动物 新生24 h的Wistar大鼠40只，雌雄不限；购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号：SCXK-(军)。

1.3 实验方法

1.3.1 重组蛋白的克隆与纯化 将野生型α-Syn和家族型突变体A53T、A30P的cDNA分别插入pET(21a)，然后转染至BL21(DE3)中，在含氨苄西林的YTA培养基中培养，诱导表达。表达的基因重组型蛋白经粗提后，经HPLC法进一步纯化。纯化后的蛋白用SDS-PAGE法鉴定，BCA法定量。

1.3.2 α-Syn聚集体的制备 终浓度100 μmol/L的野生型重组人α-Syn和家族型突变体A53T和A30P，置于PBS缓冲液中，37℃，1 000 r/min，震荡孵育48 h。然后Western印迹法检测鉴定。

1.3.3 原代神经元培养方法 将出生24 h内Wistar大鼠头部埋置碎冰中约1 min，再放入75%酒精中浸泡30 s。断头，分离鼠脑。0.25%胰酶，在37℃下消化40 min。按2×105个/cm2接种于Φ35 mm培养皿中，或1×104/孔接种于胶原包被的96孔板中。

1.3.4 神经元活力的测定 在96孔板中培养的原代神经元经样品处理后，培养至相应时间进行观察。根据MTT法细胞活力检测试剂盒操作指南，向待测的细胞培养基中添加反应液，20 μl/100 μl 培养基。5%CO2孵箱中，37℃，培养2 h。读取490 nm波长处的吸光度值，进行统计分析。

1.3.5 神经细胞流式分析仪检测 原代神经元经过寡聚体样品处理14 d后，弃去培养基，0.25%胰酶消化；2 000 r/min，离心5 min收集细胞。预冷PBS洗涤细胞2次；用400 μl Binding Buffer悬浮细胞，调整细胞浓度约为1×106cells/ml，在细胞悬浮液中加入5 μl Annexin V-FITC，混匀后于4℃避光下孵育15 min。加入10 μl PI后轻轻混匀于4℃避光孵育5 min；1 h内以FACS Calibur流式细胞仪分析检测。

1.3.6 Western印迹法和免疫荧光法鉴定α-Syn聚集体 将待测的α-Syn孵育后样本行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结束后转膜、封闭。孵育一抗，抗人重组α-Syn单克隆抗体(1∶5 000)，4℃孵育过夜。洗膜后加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育1 h。ECL法显色并拍照。

原代神经元在confocal皿中培养至相应时间后，弃去培养基，0.01 mol/L PBS漂洗细胞，预冷4%多聚甲醛室温固定30 min。含3% Triton X-100的PBS处理30 min。1% BSA，室温下封闭1 h。α-Syn单抗(1∶1 000)，4℃过夜。与相应荧光二抗在室温下避光反应2 h。DAPI封片，晾干。激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.3.7 硫磺素S染色检测胞内包涵体 经样品处理的神经元用4%PFA固定，TBS洗涤 5 min×3次。0.3%硫磺素S，室温孵育8 min。50%酒精洗涤5 min×3次，TBS洗涤5 min，1次。避光、晾干，封片，荧光显微镜观察。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0软件，组间比较用独立样本的t检验、单因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 结 果

2.1 重组蛋白纯化及寡聚体鉴定 经Western印迹法鉴定得到纯度较高的野生型α-Syn、家族型突变体A53T和A30P的单体及聚集体(图1)。根据分子量，α-Syn聚集体可见二聚体(36 kD)、三聚体(54 kD)、五聚体(90 kD)和八聚体(144 kD)。

图1 野生型α-Syn和A53T、A30P的Western印迹鉴定结果

2.2 家族型α-Syn突变体A53T、A30P的聚集体使原代神经元活力下降 向原代神经元培养基中添加终浓度为5 μmol/L的重组野生型α-Syn、A53T和A30P单体或寡聚体，培养14 d。MTT法结果显示，加入α-Syn聚集体各组的原代神经元细胞活力(51.32%)比对照组(96.26%)降低(P<0.05)，而加入突变体A53T和A30P聚集体的原代神经元细胞活力(17.82%、15.67%)比对照组(92.41%、91.02%)明显降低(P<0.01)；突变体A53T和A30P聚集体的原代神经元细胞活力下降较野生型聚集体显著(P<0.05)。向原代神经元培养基中添加相应α-Syn聚集体，培养至第1、3、5、7、14天，MTT法观察细胞活力变化，结果显示神经元的细胞活力随培养时间增加而降低(图2)。向原代神经元培养基分别添加终浓度为1、2、4、8、10 μmol/L的寡聚体，培养14 d，寡聚体组的细胞活力均随剂量的增加而降低(图3)。流式细胞术结果显示PD组总凋亡细胞数比对照组多29.85%，比NS组多16.07%。

与对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.01;与WT-α-Syn单体组比较：3)P<0.05图2 突变型α-Syn聚集体对神经元活力下降的效应具有时间依赖关系

图3 突变型α-Syn聚集体对神经元活力下降的效应具有浓度依赖关系

2.3 α-Syn聚集体在原代神经元中的分布 原代神经元经α-Syn单体或寡聚体处理后培养第14天，多聚甲醛固定，用α-Syn单抗进行免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察。结果显示α-Syn单体和各寡聚体均可以进入神经元内，并在胞体和胞质均匀分布，见图4。

2.4 α-Syn寡聚体在原代神经元内可形成淀粉样变性斑块 经α-Syn寡聚体处理的原代神经元培养14 d后，A53T和A30P组细胞内可形成明显硫磺素S染色阳性的淀粉样变性斑块。对照组神经元内无阳性染色。野生型α-Syn聚集体组神经元细胞内有较弱的硫磺素S染色，见图5。

图4 α-Syn聚集体在原代神经元中的分布(标尺=15 μm)

图5 经家族型α-Syn突变体聚集体处理的神经元可形成硫磺素S染色阳性的淀粉样斑块(标尺=10 μm)

3 讨 论

α-Syn的寡聚体被认为是其毒性形式。在PD的发病机制研究中，导致α-Syn蛋白构型异常并聚集的因素有很多。如基因突变型α-Syn，A30P和A53T在体外孵育较野生型α-Syn更易于形成寡聚体，A53T突变型可显著加快纤维蛋白聚集物的形成〔5〕。α-Syn与微管蛋白也互为分子伴侣，通过促进微管蛋白的聚合，α-Syn能够加速微管的形成〔6〕。我们的研究证实α-Syn对原代神经元早期的突起生长具有促进作用，并提高神经元的存活率〔7〕，而家族型突变体由于与微管蛋白的伴侣关系异常失去这一作用。我们进一步研究证实α-Syn的聚集体具有抑制神经元突起生长的作用〔8〕。本研究的实验结果显示α-Syn家族型突变体A53T和A30P的聚集体可以进入原代培养神经元内，从而产生神经毒性，使神经元活力下降。那么，A53T和A30P的聚集体神经毒性的机制是什么？已有研究揭示，α-Syn聚集体主要通过增加脂质双分子层通透性，破坏突触囊泡完整性以及细胞内外离子的平衡〔9〕、抑制蛋白酶体降解途径、影响细胞吞噬功能，诱导炎性反应等机制造成神经元的损伤。另外，α-Syn聚集体影响胞内物质运输，研究报道在α-Syn寡聚体大鼠病理模型中，纹状体和黑质在神经细胞丢失前，即有突触传递和轴浆运输相关蛋白发生明显变化，actin水平增加而α-微管蛋白水平降低〔10〕。我们的研究结果证实α-Syn家族型突变体A53T和A30P的聚集体在神经元内堆积形成硫黄素S染色阳性的淀粉样斑块，其机制可能与其损伤胞内微管系统，导致物质运输紊乱有关。此研究结果为揭示α-Syn的生理功能以及在家族型PD的发病机制提供新的佐证，为预防和诊断PD提供了重要依据。

1 Lou H，Montoya SE，Alerte TN，etal.Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo〔J〕.J Biol Chem，2010;285：17648-61.

2 Liu D，Jin L，Wang H，etal.Silencing alpha-synuclein gene expression enhances tyrosine hydroxylase activity in MN9D cells〔J〕.Neurochem Res，2008，33：1401-9.

3 Baba M，Nakajo S，Tu PH,etal.Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson′s disease and dementia with Lewy bodies〔J〕.Am J Pathol，1998;152(4):879-84.

4 Conway KA，Lee SJ，Rochet JC，etal.Acceleration of oligomerization，not fibrillization，is a shared property of both alpha-synuclein mutations linked to early-onset Parkinson′s disease：implications for pathogenesis and therapy〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2000;97：571-6.

5 Ferreon AC，Deniz AA.Alpha-synuclein multistate folding thermodynamics：implications for protein misfolding and aggregation〔J〕.Biochemistry，2007;46(15)：4499-509.

6 Alim MA，Hossain MS，Arima K.Tubulin seeds alpha-synuclein fibril formation〔J〕.J Biol chem，2002;277：2112-7.

7 王 鹏，许 洁，安思训，等.突变型alpha突触核蛋白对大鼠皮质神经元原代培养存活率的影响〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(18)：3952-4.

8 王 鹏，李 昕，陈予东，等.alpha突触核蛋白寡聚体抑制大鼠原代培养神经元突起早期生长〔J〕.首都医科大学学报，2014；35(5)：587-91.

9 Bultron G，Kacena K，Pearson D，etal.The risk of Parkinson′s disease in type 1 Gaucher disease〔J〕.J Inherit Metab Dis，2010;33(2)：167-73.

10 Chung CY，Koprich JB，Siddiqi H，etal.Dynamic changes in presynaptic and axonal transport proteins combined with striatal neuroinflammation precede dopaminergic neuronal oss in a rat model of alpha-synucleinopathy〔J〕.J Neurosci，2009;29(11)：3365-73.

〔2015-12-19修回〕

(编辑 徐 杰)

吉林省科技厅项目(20150101128JC)

1 北华大学基础医学院病理学教研室

盖晓东(1962-)，女，教授，硕士生导师，主要从事肿瘤分子病理学研究。

王 鹏(1977-)，男，博士，讲师，主要从事人体解剖学和神经生物学基础理论研究。

R74

A

1005-9202(2016)23-5786-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.007