槐花多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响研究

李荣乔，贾东升，温春秀，崔施展，刘灵娣，谢晓亮

（河北省农林科学院经济作物研究所，药用植物研究中心，河北石家庄050051）

槐花多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响研究

李荣乔，贾东升，温春秀，崔施展，刘灵娣，谢晓亮*

（河北省农林科学院经济作物研究所，药用植物研究中心，河北石家庄050051）

研究槐花多糖对免疫低下小鼠的免疫功能的调节作用。采用腹腔注射环磷酰胺制造免疫抑制小鼠模型，考察槐花多糖对免疫抑制小鼠脏器指数、巨噬细胞吞噬功能、淋巴细胞增殖活性、血清IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ水平、溶血素水平和溶血空斑形成数量的影响。结果表明槐花多糖能明显提高免疫抑制小鼠的胸腺指数、脾脏指数、巨噬细胞吞噬能力、脾淋巴细胞的增殖能力、溶血素含量和溶血空斑形成数量，促进细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ分泌。槐花多糖具有免疫增强活性，具有良好的开发应用潜力。

槐花；多糖；免疫功能

槐花为豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾或花，主产于我国北部、华南及西南地区，其中河北省产量较为丰富。槐花在我国食用历史悠久，经研究发现其富含多糖、多酚、黄酮、氨基酸、蛋白质、挥发油、有机酸及微量元素等多种成分[1-2]，具有辅助降血压、降血糖、增强免疫力等功效。多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键链接而成的聚糖，是生物体内一类重要的大分子，具有提高免疫能力、降血糖、抗肿瘤、抗病毒等功能，是现代医学和食品功能化学共同的研究焦点。目前槐花的研究主要集中在其黄酮类化合物及挥发油的提取、纯化及其开发利用方面，而对多糖的研究却鲜有报道。本研究采用水提醇沉法从槐花中提取槐花多糖，采用透析、离子交换层析和分子筛层析对多糖进行分离纯化得到纯度较高的槐花多糖，考察其对免疫抑制小鼠免疫功能的影响，以期为槐花的开发利用提供一定试验支持。

1 试验材料

1.1 试剂

环磷酰胺（CTX，批号：13110925）：江苏恒瑞医药股份有限公司；RPMI-1640培养基：上海浩然生物技术有限公司；刀豆素A（ConA）：江苏扬州科能生物科技有限公司；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）：北京索莱宝科技有限公司；都氏试剂：sigma公司；IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ试剂盒：美国BD公司；DEAESephadex A-25、Sephacryl-200：上海纯优生物科技有限公司；豚鼠血清、鸡红细胞：上海晶天生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

RE52CS-1旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FD-1B-50真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；EP2.5 96孔板离心机：广州科侨实验技术设备有限公司；752PC型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；MK3型酶标仪：Thermo Fisher。

1.3 材料

槐花：购于安国中药材市场；小白鼠（昆明种）：购于河北医科大学动物室。

2 试验方法

2.1 槐花多糖制备与含量测定

水提醇沉法制备槐花粗多糖，粗多糖经Sevag法脱除蛋白，采用截留分子量为3 000的透析袋透析、DEAE-Sephadex A-25离子交换层析、Sephacryl-200分子筛层析分离获得高纯度槐花多糖[3]，浓缩、冷冻干燥后得槐花多糖干燥粉，苯酚-硫酸法测定多糖含量。

2.2 槐花多糖免疫活性测定

2.2.1 小鼠分组与造模处理

将75只昆明种小鼠（体重17 g～21 g，雌性37只，雄性38只）随机平均分成空白对照组、模型对照组和槐花多糖低、中、高剂量组（低、中、高剂量分别为50、1 00、200mg/kg）共5组。正常饲养10天后，空白对照组每天腹腔注射和灌胃生理盐水各0.3mL；模型对照组每天腹腔注射CTX 30mg/kg，灌胃生理盐水0.3mL；槐花多糖低、中、高剂量组小鼠分别每天灌胃多糖溶液0.3mL，同时腹腔注射CTX 30mg/kg，分别给药21 d。

2.2.2 小鼠脏器指数测定

胸腺和脾脏是机体重要免疫器官，是淋巴细胞分化成熟的重要场所，其重量可间接反映机体免疫水平。末次给药1天后，各实验组取5只小鼠秤取活重，摘眼球取血后脱颈椎处死，摘取胸腺和脾脏，洗净、吸干后称重，按式（1）计算胸腺和脾脏指数。

2.2.3 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定

腹腔巨噬细胞在机体特异性和非特异性免疫中均具有重要功能。各实验组取5只小鼠，末次给药后腹腔注射10%鸡红细胞0.5mL，10 h后脱颈椎处死，剪开腹部皮肤用生理盐水冲洗[4]，吸取腹腔冲洗液滴于载玻片上，37℃孵育30min，用生理盐水漂洗，干燥后用固定液（丙酮∶甲醇=1∶1）固定，瑞氏染液染色，利用油镜观察，计数，按式（2）和式（3）计算吞噬率及吞噬指数[4-5]。

2.2.4 脾淋巴细胞增殖活性的测定

脾淋巴细胞转化能力是评价机体细胞免疫功能的主要指标。取“2.2.2”所得小鼠脾脏，制备脾细胞并调整浓度[6]，各取脾细胞1mL至24孔培养板中，加入200mg/LConA溶液75μL，RPMI-1640完全培养液代替ConA做对照，培养72 h[7]。培养68 h后各取上清液0.7mL，加入RPMI-1640（不含小牛血清）培养液0.7mL和已除菌的5mg/mLMTT溶液80μL，继续培养4 h。培养结束后各加入酸性异丙醇1mL，混合均匀，每孔3个平行转移至96孔培养板中，利用酶标仪于570nm处测定吸光值[8-10]，按式（4）计算淋巴细胞增殖指数。

式中：A处理为加ConA孔吸光值；A对照为空白孔吸光值。

2.2.5 血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ的测定

细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和TNF-γ在机体免疫细胞活化过程中起促进作用。取2.2.2摘眼球所取血液，离心取血清，按试剂盒的说明操作，检测各组小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ水平。

2.2.6 溶血素及溶血空斑形成测定

血清溶血素和溶血空斑水平与机体体液免疫水平相关。于“2.2.1”方法基础上，给药第一天各组取5只小鼠腹腔注射5%的鸡红细胞0.3mL进行免疫，末次给药1 h后摘取眼球取血，离心取血清用生理盐水稀释，将稀释血清、5%鸡红细胞和10%新鲜豚鼠血清以2∶1∶1（体积比）比例混匀，以生理盐水代替豚鼠血清做空白对照，37℃保温30min，4℃离心，于540 nm处测定上清液的吸光值，检测溶血素水平[11]。

小鼠取血致死后，取脾脏并匀浆，用都氏液调整细胞个数至4×109/mL。将脾细胞悬液、0.2%鸡红细胞和10%新鲜豚鼠血清以1∶1∶1（体积比）比例混匀，生理盐水代替豚鼠血清做空白对照，37℃保温1 h，离心，于413 nm处测定上清液的吸光值，检测溶血空斑数量[11]。

2.3 数据处理

数据采用SAS9.1软件进行统计分析，以平均值±标准差（±SD）表示数值，差异显著性分析采用单因素方差分析。

3 结果与分析

3.1 槐花多糖含量测定

多糖含量测定标准曲线：Y=0.005 7X+0.041 2，R2= 0.999 1，槐花纯化多糖的得率为2.15%，多糖含量为91.33%。

3.2 槐花多糖对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响

槐花多糖对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响见表1。

表1 槐花多糖对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响（±SD）Table1 Effectof SFP on immuneorgan indexes in immunosuppressivem ice（±SD）

表1 槐花多糖对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响（±SD）Table1 Effectof SFP on immuneorgan indexes in immunosuppressivem ice（±SD）

注：▲▲与正常组比较P<0.01；★与模型组比较P<0.05；★★与模型组比较P<0.01。

组别 剂量/（mg/kg） 胸腺指数/（mg/g） 脾脏指数/（mg/g）正常组 0 3.713±0.402 5.327±0.493模型组 0 1.487±0.153▲▲ 3.234±0.356▲▲低剂量组 50 1.751±0.172★ 3.673±0.437中剂量组 100 2.312±0.292★★ 4.036±0.486★高剂量组 200 3.254±0.324★★ 4.638±0.482★★

由表1可以看出，模型组小鼠脏器指数均显著降低（P<0.01），造模成功。50mg/kg槐花多糖可以显著增加胸腺重量，但对脾脏重量无影响；100mg/kg槐花多糖可以增加脾脏重量，对胸腺增重影响极显著；200mg/kg槐花多糖对胸腺和脾脏增重均有极显著影响。

3.3 槐花多糖对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

槐花多糖对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响见表2。

表2 槐花多糖对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（±SD）Table2 Effectof SFP on abdom inalcavitymacrophage function in immunosuppressivem ice（±SD）

表2 槐花多糖对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（±SD）Table2 Effectof SFP on abdom inalcavitymacrophage function in immunosuppressivem ice（±SD）

注：▲▲与正常组比较P<0.01；★与模型组比较P<0.05；★★与模型组比较P<0.01。

组别 剂量/（mg/kg） 吞噬率/% 吞噬指数正常组 0 42.568±5.563 0.562±0.063模型组 0 27.362±3.462▲▲ 0.354±0.042▲▲低剂量组 50 31.416±3.049 0.382±0.043中剂量组 100 35.372±4.283★ 0.421±0.045★高剂量组 200 40.134±4.361★★ 0.503±0.054★★

由表2可以看出，模型组小鼠巨噬细胞的吞噬功能显著降低（P<0.01），造模成功。50mg/kg槐花多糖对巨噬细胞的吞噬功能无显著影响，100mg/kg槐花多糖可以显著提高巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数；当槐花多糖剂量达200mg/kg时可以极显著提高吞噬率和吞噬指数。

3.4 槐花多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响

槐花多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响见表3。

表3 槐花多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响（±SD）Table3 Effectof of SFP on lymphocyte proliferation in imm unosuppressivem ice

表3 槐花多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响（±SD）Table3 Effectof of SFP on lymphocyte proliferation in imm unosuppressivem ice

注：▲▲与正常组比较P<0.01；★与模型组比较P<0.05。

组别 剂量/（mg/kg） 脾淋巴细胞增殖指数正常组 0 89.426±9.164模型组 0 65.437±7.531▲▲低剂量组 50 70.762±7.537中剂量组 100 74.742±7.513高剂量组 200 79.260±7.433★

由表3可以看出，模型组小鼠脾淋巴细胞的增殖能力显著降低（P<0.01），造模成功。50mg/kg和100mg/kg槐花多糖对淋巴细胞增殖活性无显著影响，当剂量达200mg/kg时可以显著提高淋巴细胞增殖活性。

3.5 槐花多糖对免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量的影响

槐花多糖对免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量的影响见表4。

表4 槐花多糖对免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量的影响（±SD）Table4 Effectof SFP on the the levalof IL-2，IL-4，IL-6，TNF-α，TNF-γin immunosuppressivem ice（±SD）

表4 槐花多糖对免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量的影响（±SD）Table4 Effectof SFP on the the levalof IL-2，IL-4，IL-6，TNF-α，TNF-γin immunosuppressivem ice（±SD）

注：▲▲与正常组比较P<0.01；★与模型组比较P<0.05；★★与模型组比较P<0.01。

组别 剂量/（mg/kg） IL-2/（pg/mL） IL-4/（pg/mL） IL-6/（pg/mL） TNF-α TNF-γ正常组 0 32.173±2.658 37.656±3.912 248.712±54.631 467.292±100.215 1.048±0.214模型组 0 14.415±1.533▲▲ 22.562±2.734▲▲ 113.562±13.655▲▲ 254.167±25.149▲▲ 0.455±0.076▲▲低剂量组 50 17.257±2.169★ 25.224±2.613 138.657±22.397 295.345±30.632★ 0.526±0.082中剂量组 100 21.516±2.327★★ 28.572±3.013★ 164.198±32.338★ 317.326±35.461★ 0.616±0.091★高剂量组 200 26.537±3.206★★ 30.261±3.672★★ 182.354±37.335★★ 362.725±42.068★★ 0.725±0.115★★

由4可以看出，模型组小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量显著降低（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。50mg/kg槐花多糖可以显著提高免疫抑制小鼠血清中IL-2和TNF-α含量，对IL-4、IL-6、TNF-γ含量无显著影响；100mg/kg槐花多糖可以显著提高血清中IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量，对IL-2含量增加有极显著影响；当槐花多糖剂量达200mg/kg时对IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ水平提高均有极显著影响。

3.6 槐花多糖对免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影响

槐花多糖对免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影响见表5。

表5 槐花多糖对免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影响（±SD）Table5 Effectof SFP on the formation of hemolysin and hem olytic plaque in immunosuppressivem ice（±SD）

表5 槐花多糖对免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影响（±SD）Table5 Effectof SFP on the formation of hemolysin and hem olytic plaque in immunosuppressivem ice（±SD）

注：▲▲与正常组比较P<0.01；★与模型组比较P<0.05；★★与模型组比较P<0.01。

溶血空斑A413nm（n=5）正常组 0 0.535±0.052 0.352±0.043模型组 0 0.335±0.028▲▲ 0.182±0.031▲▲低剂量组 50 0.376±0.037 0.213±0.029中剂量组 100 0.417±0.047★ 0.246±0.037★高剂量组 200 0.465±0.056★★ 0.283±0.034★★组别 剂量/（mg/kg） 溶血素A540nm（n=10）

由表5可以看出，模型组小鼠溶血素水平和溶血空斑形成数量与正常组相比显著下降，造模成功。50 mg/kg槐花对免疫抑制小鼠血清溶血素水平、溶血空斑水平均无无显著影响；100mg/kg槐花多糖对溶血素和溶血空斑水平提高有显著影响；当槐花多糖剂量达200mg/kg时可极显著提高溶血素和溶血空斑水平。

4 讨论

本研究通过注射药物CTX建立小鼠免疫功能低下模型。注射CTX后小鼠免疫器官脾脏和胸腺重量减轻，腹腔巨噬细胞吞噬率、淋巴细胞增殖指数、血清溶血素和溶血空斑水平、细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和TNF-γ水平与对照组相比均明显下降，免疫抑制模型造模成功。通过试验发现，50mg/kg槐花多糖可以显著显著增加胸腺重量，提高免疫抑制小鼠血清中IL-2和TNF-α含量；100mg/kg槐花多糖可以显著提高巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率、吞噬指数、溶血素和溶血空斑水平，提高血清中IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ含量，对IL-2含量增加有极显著影响；当槐花多糖剂量达200mg/kg时可以显著提高淋巴细胞增殖活性，对吞噬率和吞噬指数增加和IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-γ、溶血素和溶血空斑水平提高均有极显著影响。综上，槐花多糖对免疫抑制小鼠的免疫反应起正调节作用。

本研究发现槐花多糖对免疫低下小鼠的非特异性免疫系统、细胞免疫和体液免疫功能均有重要的促进作用。有研究报道，多糖的活性很大程度上与其结构相关，经化学修饰后多糖生物活性会明显增强或产生新的活性[11-12]，因此，为充分发挥槐花多糖的功效，有以下工作需要进一步展开：（1）研究槐花多糖的结构，如单糖构成、硫酸基团的位置，硫酸化程度以及糖苷键的位置、分子质量等；（2）探讨槐花多糖改善免疫功能的作用机理；（3）通过硫酸化、磷酸化、羧甲基化、乙酰化、烷基化、硒化等修饰进一步提高其改善免疫功能活性，并对槐花多糖的其他生物活性进行研究。

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Investigation on the Influence of Polysaccharide From Sophora japonica Flower Polysaccharides on Imm unological Function of M ice

LIRong-qiao，JIADong-sheng，WENChun-xiu，CUIShi-zhan，LIU Ling-di，XIEXiao-liang*
（CentreofMedicinal PlantResearch，InstituteofCash CropsofHebeiAcademyofAgricultureand Forestry Sciences，Shijiazhuang 050051，Hebei，China）

To investigate the effectof Sophora japonica flower polysaccharides（SFP）on immume function in immunosuppressivemice.Micewere injected with CTX to establish the immunosuppressivemodel.The effectsof differentdosesof SFPon the index of thymusand spleen，peritonealmacrophage activity，lymphocyte proliferation activity，the levelsof IL-2，IL-4，blood serum hemolysin and hemolytic plaque inmicewere detected.SFP waseffective in improving the immune function of immunosuppressivemice，improved the index of thymusand spleen，the phagocytic activity ofperitonealmacrophage，the proliferation activity of splenic lymphocytes，the formation ofhemolysin and hemolytic plaque，promote the secretion levelof IL-2，IL-4，IL-6，TNF-α，TNF-γ. SFPcould enhance the immunologicalactivity，showed agood exploitability.

Sophora japonica flower；polysaccharide；immunological function

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.037

2016-03-16

河北省中药材产业体系项目（2013001D）；河北省农林科学院青年基金项目（A2015 050101）；河北太行山区特色功能保健食品的开发研究（11231005D）

李荣乔（1989—），女（汉），硕士研究生，主要从事功能食品开发研究。

*通信作者：谢晓亮（1962—），男（汉），研究员，博士，主要从事中药资源、中药加工研究。