不同产区浓香型白酒窖泥中细菌多样性分析

于春涛，刘超

（沧州医学高等专科学校，河北沧州061001）

不同产区浓香型白酒窖泥中细菌多样性分析

于春涛，刘超

（沧州医学高等专科学校，河北沧州061001）

以十里香窖泥（河北沧州）、景阳春窖泥（山东景芝镇）、泸州老窖窖泥（四川泸州）和龙江家园窖泥（黑龙江双城）为研究对象，利用变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）和基因测序技术对窖泥中的细菌和乳酸菌的多样性进行分析。结果表明：在4种窖泥样品景阳春窖泥中细菌多样性最低，龙江家园窖泥中细菌多样性最高；十里香窖泥中乳酸菌的多样性最低，泸州老窖窖泥中乳酸菌的多样性最高。窖泥中的细菌以厚壁菌门为主，乳酸菌以乳酸杆菌为主，不同产区窖泥中细菌和乳酸菌的组成存在着差异。上述结果说明浓香型白酒窖泥中细菌多样性与其产区之间存在一定联系。

浓香型白酒；窖泥；细菌；乳酸菌；多样性；变形梯度凝胶电泳

白酒是一种由粮食发酵而来的蒸馏酒，其中以浓香型的白酒产量最高，并且由其浓郁的窖香风味深受人们的喜爱[1-2]。窖泥在浓香型白酒生产过程中发挥着重要的作用，并在长期的演化过程中形成了其独特的微生物特征，并通过这些微生物的发酵会赋予白酒独特的风味[3-4]。不同地区的浓香型白酒其组成成分和风味具有显著的差异，造成这些差异的主要原因是其窖泥中微生物的不同，因此对不同产区浓香型白酒窖泥进行微生物多样性的分析十分必要[5-6]。

浓香型白酒窖泥中的微生物包括了细菌、古细菌和真菌，其中细菌是窖泥微生物中优势的群体，此外，乳酸菌在浓香型白酒的发酵过程中发挥着重要的作用，其代谢产物乳酸乙酯有助于白酒风味的形成[7-8]。本研究利用变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）技术揭示不同产区窖泥中细菌和乳酸菌多样性的差异，为阐述不同产地浓香型白酒酒体风格不同的原因提供理论参考。

1 材料与仪器

1.1 主要材料

1.1.1 样品来源

窖泥分别采自十里香窖泥：河北沧州；景阳春窖泥：山东景芝镇；泸州老窖窖泥：四川泸州；龙江家园窖泥：黑龙江双城，分别标号为A、B、C和D，窖龄均为30年。每个窖池选取其上层、中层和底部进行采样，混合后-20℃保藏待用。

1.1.2 主要试剂

MIBIO UltraClean SoilDNA Isolation Kit、2×Taq PCRMasterMix（含染料）、Marker I：均购自北京天根生化科技有限公司；琼脂糖：南京生兴生物；无水乙醇：上海博谷生物；引物BA338f和UN518r，Lac1和Lac2，40 bp“GC”：北京诺赛基因组研究中心有限公司。

1.2 试验仪器

TG328A电子分析天平：上海精科天美仪器有限公司；TD5A-WS台式大容量离心机：常州市万合仪器制造有限公司；HH-8恒温水浴锅：常州市金坛区环宇科学仪器厂；BG-Power600通用电泳仪电源：上海珂淮仪器有限公司；变性梯度凝胶（DGGE）电泳仪：美国Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 样品DNA提取及PCR扩增

根据邓杰等[9]的报道，利用MIBIOUltraClean SoilDNA Isolation Kit对不同产区的窖泥细菌DNA进行提取。以上述DNA为模板，对其进行细菌16S rRNA V3区和乳酸菌PCR扩增。细菌16SrDNAV3区扩增采用通用引物BA338f和UN518r（5’-端加一个40bp“GC”夹），乳酸菌扩增引物采用Lac1和Lac2（5’端加一个40 bp“GC”夹），反应体系和扩增条件参考已有报道[10-11]。

2.2 DGGE分析

细菌16SrDNA V3区DGGE分析的变性凝胶梯度为30%～55%，上样量为30μL、反应温度为60℃、电压120 V、电泳14 h[12]；乳酸菌DGGE分析采用30%～50%的变性梯度，上样量为30μL、反应温度为60℃、电压70V、电泳16 h[11]。电泳结束后将DGGE胶用去离子水清洗，之后在1%的GeneFinder中避光染色30 min，UVP凝胶成像记录DGGE图谱，并利用Shannon-Weaver指数分析窖泥细菌度多样性。

2.3 基因测序

将染色后的胶体至于紫外灯下，利用无菌手术刀快速切割胶体中不同位置的条带，去离子水清洗，捣碎，加入50 uL去离子水，在4℃冰箱过夜。以上清液为模板，采用没有GC夹的引物进行PCR扩增，对PCR产物进行测序分析，并将测序得到的基因序列在NCBI数据库中进行Blast比对，确定条带所代表的菌株的菌属。

3 结果与分析

3.1 不同产区窖泥中细菌和乳酸菌PCR扩增结果

利用1%琼脂糖凝胶电泳分别对窖泥中的细菌DNA和乳酸菌DNA扩增产物进行检验，结果如图1所示。

图1不同产区窖泥DNA扩增产物Fig.1 Amplification productof DNA of pitmud sam ples from different producing regions

图1 （a）中，4个窖泥样品DNA的16S rRNAV3区扩增产物的目的条带均一清晰，大小都在200 bp左右，无杂带，可认定为细菌16S rRNA V3区目的条带。图1（b）中，所有样品的条带大小在400 bp左右，条带均一清晰，可认为为乳酸菌的目的条带。

3.2 不同产区窖泥细菌多样性分析

利用DGGE电泳技术分析浓香型白酒窖泥中细菌的生物多样性，并利用Shannon-Weaver指数评估其多样性，PCR-DGGE图谱结果见图2、图3，生物多样性结果见图4。

图2 不同产区窖泥样品细菌DGGE图谱Fig.2 DGGE profileofbacteria of pitmud sam ples from different producing regions

图3 不同产区窖泥样乳酸菌DGGE图谱Fig.3 DGGE profileof lactic acid bacteria ofpitmud samples from different producing regions

由图2和图3中可以看出不同产区的窖泥样本的细菌和乳酸菌DGGE图谱中具有一定的差异，在细菌图谱中共分离出12个不同位置的条带，在乳酸菌图谱中共发现8个位置不同的条带。由图4（a）可知，B（景阳春窖泥）窖泥中细菌多样性最低，D（龙江家园窖泥）中细菌多样性最高。由图4（b）中可知A（十里香窖泥）窖泥中乳酸菌的多样性最低，而C（泸州老窖窖泥）窖泥中乳酸菌的多样性最高。上述结果表明不同产区浓香型白酒窖泥中细菌和乳酸菌的多样性存在一定的差异。

3.3 DGGE图谱优势条带测序分析

利用基因测序技术对DGGE图谱中的优势条带进行测序分析，条带的位置选取如图2和图3所示，测序结果如表1。

表1 不同产地窖泥细菌和乳酸菌DGGE图谱中条带Blast对比结果Table1 Blast resultof bands in DGGE profilesof bacteria and lactic acid bacteria of pitmud sam ples from different producing regions

其中瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）、未培养的假单胞菌（Uncultured Pseudomonadaceae）、Caloramator mitchellensis、喜盐芽孢杆菌属（Haloballus）和Uncultured bacterium在4个产区的窖泥中均有发现；梭菌属（Clostridium sp.）、乳酸杆菌（Lactobacillussp.）和喜热菌（Caloramator）只存在于A（十里香窖泥）、B（景阳春窖泥）和C（泸州老窖窖泥）中；Uncultured Synergistaceae和消化杆菌科（Peptococcaceae）只存在于D（龙江家园窖泥）中；未培养的盐扁菌（Uncultured Haloplasmataceae）则只存在于3（泸州老窖窖泥）中。

窖泥中乳酸菌的测序选取了8条不同位置的条带，其中4个不同产地浓香型白酒窖泥中都含有发酵乳酸菌（L.fermentum）、乙酰微小杆菌（Exiguobacterium acetylicum）和未培养的乳酸杆菌（Uncultured Lacto－bacillus）；柠檬明串球菌（Leuconostoc citreum）和耐酸乳杆菌（L.acetotolerans）存在于B（景阳春窖泥）、C（泸州老窖窖泥）和D（龙江家园窖泥）中；融合魏斯氏菌（Weissella confusa）存在于B（景阳春窖泥）、C（泸州老窖窖泥）中；L.odoratitofui则存在于A（十里香窖泥）、B（景阳春窖泥）和C（泸州老窖窖泥）中。

4 讨论

Shannon-Wiener指数能够用于评估样品中微生物的多样性，Shannon-Wiener值越高表示样品中微生物的种类越多，其多样性就越高[11]。本试验中4个窖泥样品的细菌和乳酸菌Shannon-Wiener值差异明显，说明不同产区的浓香型白酒的窖泥中细菌和乳酸菌中的种类和数量存在着地域性的差异。在此基础上，基因测序的结果表明，4个不同产区的窖泥中细菌和乳酸菌的种类也有所差异，这可能是不同产区浓香型白酒风味各具特点的重要原因之一。

4个不同产区浓香型白酒的窖泥中主要的细菌分别属于Firmicutes（厚壁菌门），Synergistaceae（互养菌门），Chloroflexi（绿弯菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Acidobacteria（酸杆菌门）和Lentisphaerae（黏胶球形菌门），其中厚壁菌门为优势菌门。其中互营共养单胞菌属、喜热菌属和梭菌属能够产生乙酸、丙酸、丁酸等有机酸，从而进一步反应生成以己酸乙酯、丁酸乙酯为主体的复合香气[4]。除此之外，乳酸菌也是窖泥中的功能菌，主要参与风味物质乳酸乙酯的形成。本研究中4个不同产区浓香型白酒的窖泥细菌和乳酸菌的组成既有相同菌株也有特有菌株，这说明窖泥中细菌及乳酸菌的组成既有相似的组成，也会由于不同地域土壤成分、天气或生产工艺的差异而具有独特性。

[1]岳元媛,张文学,刘霞,等.浓香型白酒窖泥中兼性厌氧细菌的分离鉴定[J].微生物学通报,2007,34(2):251-255

[2]施思,王海英,张文学,等.浓香型白酒不同窖泥的微生物群落特征分析[J].酿酒科技,2011(5):38-41

[3]刘森.中国浓香型白酒窖池窖泥中原核微生物群落空间异质性研究[D].成都:西华大学,2013

[4]王明跃,张文学.浓香型白酒两个产区窖泥微生物群落结构分析[J].微生物学通报,2014,41(8):1498-1506

[5]杜礼泉,罗惠波,黄治国,等.微生物群落相关技术在窖泥微生物研究中的应用[J].酿酒,2014,41(4):42-49

[6]张金修,张雪飞.探讨浓香型白酒中微量成分与酒质的关系[J].酿酒科技,2013(7):72-74

[7]熊亚,陈强,唐玉明,等.泸州老窖不同窖龄窖泥中乳酸菌多样性PCR-DGGE分析[J].应用与环境生物学报,2013(6):1020-1024

[8]黄治国,赵斌,卫春会,等.浓香型白酒窖泥古菌群落结构研究及其系统发育学分析[J].现代食品科技,2014(3):28-32

[9]邓杰,黄治国,卫春会,等.基于高通量测序的浓香型白酒窖池细菌群落结构分析[J].现代食品科技,2015(7):205-210

[10]费鹏,白洪健,程述震,等.PCR—DGGE法分析婴儿肠道菌群多样性[J].食品与机械,2013,29(2):60-63

[11]费鹏.轮状病毒腹泻婴儿肠道微生态变化的研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2013

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Analysis of Bacterial Diversity in Different Areas of Strong Aromatic Chinese Spirit in Pit M ud

YUChun-tao，LIUChao
（Cangzhou MedicalCollege，Cangzhou 061001，Hebei，China）

The pitmud from Shilixiang（HebeiCangzhou），King spring（Shandong JingZhi town），Luzhou laojiao（Sichuan Luzhou）and Longjiang home（Heilongjiang Shuangcheng）were the research objects.The diversity of bacteria and lactic acid bacteria were analyzed using the denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）and gene sequencing technology.Among the four samples in pitmud，the bacterial diversity of King springwas the lowest，which of Longjiang homewas the highest；the diversity lactic acid bacteria of Shilixiang was the lowest，which of Luzhou laojiaowas the highest.The Firmicuteswas themain phylum in bacteria，the Lactobacilluswas the dominantgenus in lactic acid bacteria.Therewere some difference in the composition of bacteria and lactic acid bacteria in pitmud from different producing regions.These results demonstrated that therewasa connection between bacterialdiversity ofpitmud and their producing regions.

strong aromatic Chinese spirit；pitmud；bacteria；lactic acid bacteria；diversity；denaturing gradientgelelectrophoresis（DGGE）

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.035

2016-08-10

于春涛（1979—），男（汉），讲师，硕士研究生，主要研究方向：微生物发酵。