红花提取工艺筛选考察

金玉翠，张惠惠，尹 雷，王少平，代 龙，李凌军*

(1.山东中医药大学，济南 250355；2.安徽生物肽产业研究院有限公司，安徽 芜湖 241000)



红花提取工艺筛选考察

金玉翠1，张惠惠1，尹 雷2，王少平1，代 龙1，李凌军1*

(1.山东中医药大学，济南 250355；2.安徽生物肽产业研究院有限公司，安徽 芜湖 241000)

目的 采用不同方式对红花药材进行提取，得出最佳提取工艺，并对药液进行纯化考察，得出最佳参数。方法 采用水提取，乙醇提取，醇提水沉等方式对红花进行提取，以羟基红花黄色素A提取率作为指标，比较不同提取方式的抗凝血作用，得出最佳提取方式。并对药液进行浓缩条件和醇沉条件考察，得出最佳工艺参数。结果 对红花有效成分提取时采用水提取效果最佳，羟基红花黄色素A提取率可以达到86.11%，可明显延长大鼠血浆凝血酶时间、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间,得出当加水8倍量,每次煎煮0.5 h，煎煮2次，红花提取液中有效成分提取最好。同时红花药液采用醇沉处理时，70%乙醇进行沉淀，除杂率最佳，成分保留率最好，采用减压浓缩时，温度控制为65 ℃，压力在-0.07 MPa时，浓缩效果最佳。有效成分破坏率最小。结论 红花采用水作为溶剂进行提取，方法简便易行，适合大生产操作。

红花；提取率；除杂率；羟基红花黄色素A

红花为菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花。具有活血通经，散瘀止痛等功效，用于经闭，痛经，恶露不行，癥瘕痞块等疾病的治疗[1]。现代研究[2-4]表明其有效成分为羟基红花黄色素A,具有扩张血管、抑制血小板聚集、抗炎等多种药理作用，主治缺血性脑血管疾病、冠心病等。羟基红花黄色素A在提取过程中易破坏造成分解，因此造成其提取率低[5-8]。笔者主要考察不同提取与处理方式对羟基红花黄色素A的提取效果，得出最佳工艺以用于大生产。

1 材料

1.1 仪器 R1002型旋转蒸发器(上海申顺生物科技有限公司)；LC-2010A型高效液相色谱仪(日本岛津)；KQ-500E型超声波提取器(昆山市超声仪器有限公司)；AB135-S十万分之一型天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；AL-204型万分之一天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；PK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试剂 羟基红花黄色素A对照品：购自中国药品生物制品检定所(批号：20120809，供含量测定用)，无水乙醇为分析纯，去离子水，甲醇、乙腈(德国MERCK公司)、磷酸(美国TEDIA公司)、乙酸(美国TEDIA公司)等为色谱纯，凝血酶原时间(PT)测定试剂盒、凝血酶时间(TT)测定试剂盒、活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒(上海通蔚生物科技有限公司)，戊巴比妥钠、枸橼酸钠(上海西唐生物公司)。红花药材(购于亳州，经山东中医药大学生药学教授周凤琴老师鉴定为道地药材)。

1.3 实验动物 SD小鼠，体质量18～20 g，购于山东中医药大学实验动物中心。

2 方法

2.1 不同提取方式的考察 水温浸直接提取：取红花药材100 g，加水8倍量，温浸2 次，温度60 ℃，每次0.5 h。合并药液，高速离心5 min(4 500 r/min)。量取50 mL，蒸干。25%甲醇超声30 min，称重，25%甲醇补重，定容至50 mL，作为样品1。

50%乙醇提取：取红花药材100 g，加50%乙醇8倍量，60 ℃回流2次，每次0.5 h，合并乙醇液，减压回收乙醇至无醇味，蒸干，取干膏适量，加甲醇溶解定容至50 mL，作为样品2。

醇提水沉提取：取红花药材100 g，加90%乙醇回流提取，合并乙醇液，加水至70%乙醇。放置过夜，过滤；沉淀蒸干。取沉淀适量，加甲醇定容至50 mL，作为样品3。

2.2 含量测定结果

2.2.1 色谱条件 色谱柱：kromasl C18硅胶柱；检测波长：403 nm；流速1.0 mL/min；柱温：30 ℃；流动相：甲醇-0.5%磷酸溶液(25∶75)。

2.2.2 对照品溶液配制 取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加25%甲醇制成每1 mL含0.13 mg的溶液，即得。

2.2.3 样品实验数据 分别向高效液相中注入样品1、2、3和对照品溶液各10 μL。分析实验数据得出见表1。

表1 样品数据

注:按照中国药典红花药材项下含量测定方法，红花药材中羟基红花黄色素A含量为1.56%，符合药典规定。提取率=实际提取量/相应成分在样品中的含量

由表1数据可知，采用3种不同提取方式对红花药材进行提取时，采用水温浸直接提取时，羟基红花黄色素A提取率最高。2.3 抗凝血试验 取SD小鼠40只,每组10只，随机分为空白对照组、水温浸提取组、50%乙醇提取组、醇提水沉组。采用灌胃给药的方式。空白对照组给予1 g/kg生理盐水，其余各组动物给予1.5 g/kg(生药/体质量)红花提取液，连续灌胃5 d，第5天给药1 h后，各鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，心脏取血，置入含3.8%枸橼酸钠的离心管中，动物血与抗凝剂的比例严格控制为9∶1，混匀后以3 000 r/min离心15 min，得血小板血浆，置冰浴中备用，用凝固比浊法[9]测定凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)。结果见表2。

表2 不同提取方式抗凝血实验结果(n=10) s

注:与空白对照组比较,#P<0.05，##P<0.01

结果可知，采用水温浸直接提取时，提取液的抗凝效果最佳，结合羟基红花黄色素A的提取率，采用水温浸方法对红花药材进行提取。

2.4 正交设计优选条件 试验中采用水温浸对红花药材进行提取，但是羟基红花黄色素A长时间受热易分解，同时水提取过程中加水量，时间都会对提取造成很大影响。因此采用正交实验对红花水温浸提取进行考察。

2.4.1 因素水平表的设计 见表3。

表3 红花提取工艺因素水平

2.4.2 正交试验结果 见表4，表5。

表4 红花提取工艺正交试验结果

表5 正交试验方差分析结果

注:#P<0.05

由以上数据分析可知:A、B、C三因素影响羟基红花黄色素A提取率的主次顺序为：A>B>C，即提取时间>提取次数 >溶剂倍量，结果证明了羟基红花黄色素A久煎被破坏，则最佳提取工艺为：A1B2C2，即加8倍量水，提取2次，每次0.5 h。羟基红花黄色素A提取率可以达到85.27%。

2.4.3 提取工艺验证试验结果 结果表明：水温浸最佳工艺可行，可以作为红花的提取工艺。

2.5 浓缩工艺考察结果 结果表明：减压浓缩方式对羟基红花黄色素A基本没有破坏，而常压较大，考虑到受热时间长会造成有效成分损失，则采用减压浓缩方式。

2.6 醇沉纯化工艺参数优选 结果表明:对红花浓缩液进行不同浓度醇沉处理，可以降低得膏率，但是对羟基红花黄色素A转移率基本无影响，当乙醇浓度到70%以上得膏率变化不明显，同时考虑到节省物料，选择醇沉到乙醇浓度为70%即可。

3 结论

采用不同提取工艺对红花药材进行提取考察，结果显示采用直接水温浸时，红花中的有效成分提取率和保留率最高，同时对各种提取方法得到的提取液进行抗凝实验[9]。得出水温浸方法提取红花时，抗凝效果优于其他组别，因此采用直接水温浸方法对红花进行处理。在实验过程中也对红花提取液做浓缩处理。得出最佳浓缩条件。为药物提取后的纯化处理提供了便利。水温浸直接提取红花中的有效成分，提取条件容易控制，节约成本。操作简单。因此对药厂大规模提取提供了方向。

[1]中华人民共和国药典委员会.中国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

[2]常海涛,韩宏星,屠鹏飞,等.中药红花化学成分及药理作用[J].国外医药(植物药分册),1999,14(5):201-203.

[3]蔡薇,黄罗生,金雪锋,等.红花提取工艺探讨[J].海峡药学,2007,19(2):50-52.

[4]周素娣,仲惠娟.HPLC测定西红花提取物及其片剂中各西红花苷含量[J].药物分析杂志,1998,18(3):159-162.

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[8]刘玉杰,年春红.红花中红花黄色素的提取与纯化工艺研究[J].中国民族医药杂志,2008,14(4):62.

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Extraction process of safflower screening study

JIN Yucui1,ZHANG Huihui1,YIN Lei2,WANG Shaoping1,DAI Long1,LI Lingjun1*

(1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China;2.Anhui Biological Peptide Industry Research Institute co.,LTD,Wuhu 241000,Anhui Province,China)

Objective To adopt different extraction methods for extraction of safflower medicinal,the extraction process,and liquid purification study,get the optimum parameters.Methods Using water extraction,ethanol extraction,water sedimentation,etc.to extract the safflower medicinal;regard HSYA A extraction rate as indicator to get the optimum extraction method.Concentrated liquid conditions and alcohol precipitation conditions investigated,get optimum process parameters.Results Water extract active of safflower is the best method,the HSYA A extraction rate can reach 86.11%,when using the water eight times the amount of 0.5 hours each boiling,2 times,safflower extract active ingredients is the best.Using alcohol precipitation of the safflower liquid,and precipitated with 70% ethanol,rate of impurity is the best,retention of ingredients is the best.When using concentrated under reduced pressure,the temperature controlled to 65 ℃,the pressure in the -0.07 MPa,and results of concentrated is the best.The rate of the active ingredient damage is the minimum.Conclusion Safflower using water as solvent to extract,the method is simple and easy,suitable for mass production.

safflower;extraction rate;purification rate;HSYA A

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.013

“十二五”国家科技重大专项课题“四味中药有效组分治疗缺血性中风的新药成药性研究”(20132X09103002-021)。

金玉翠(1990-)，女，硕士研究生，主要从事中药新制剂、新剂型研究。

R284.2

A

2095-6258(2016)06-1139-03

辑：张海洋

2016-06-16)

*通信作者：李凌军，男，副教授，硕士研究生导师，电话-15953176976，电子信箱-lljun66@yahoo.com