马尾松桐棉种源天然群体遗传结构研究

冯源恒， 李火根， 杨章旗， 吴东山

( 1. 广西壮族自治区林业科学研究院， 南宁 530002； 2. 南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室， 南京 210037 )



马尾松桐棉种源天然群体遗传结构研究

冯源恒1,2， 李火根2， 杨章旗1*， 吴东山1

( 1. 广西壮族自治区林业科学研究院， 南宁 530002； 2. 南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室， 南京 210037 )

广西桐棉是我国重要的马尾松优良种源区，该种源分布面积达1.56万hm2，马尾松遗传资源优质且丰富，但近30年来该地区的马尾松天然资源受到较为严重的破坏。为了解该地马尾松天然种质资源的遗传多样性现状，该研究利用SSR分子标记分析了桐棉马尾松的群体遗传结构。结果表明：16 对 SSR 引物在285 个样本中共检测到 53个等位基因，多态位点百分率为100%。桐棉群体的平均等位基因数(Na)、平均有效等位基因数(Ne)、Shannon 多样性指数(I)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)分别为3.31、1.68、0.64、0.35和0.36，可见桐棉群体现今仍具有较高的遗传多样性。群体的遗传分化系数(GST)为0.049，固定指数(FST)为0.072，基因流(Nm)为3.21。这说明桐棉群体内基因型分布接近于平衡状态，未出现明显的杂合子过剩或不足，遗传变异主要存在于林分内，林分间不存在明显的遗传分化，群体内基因交流顺畅。同时，处于桐棉种源核心区域的4个林分遗传多样性水平显著低于核心区外围的3个林分，说明桐棉种源核心区域遭到更为严重的人为破坏。为了保障该处马尾松天然群体的正常更新及自然遗传改良能力应重视对马尾松天然林的科学管护。一方面通过遗传资源选择收集，建立大规模种质资源库；另一方面，对于桐棉种源这类分布面积大、利用价值高、目前所受破坏尚不严重的天然群体，应建立专门的自然保护区，严禁盗伐、主伐、非法采割松脂及过度采种。该研究结果对于马尾松天然种质资源的研究与保护具有重要参考价值。

马尾松， 天然群体， 遗传结构， SSR， 种源

马尾松(Pinusmassoniana) 是我国重要的造林树种，林分总面积居全国针叶树种首位，蓄积量仅次于云杉、冷杉和落叶松，居全国针叶树种第四位。其木材和松脂是许多森林工业、造纸工业和林产化工业的主要原料(周政贤，2001)。从“六五”计划至今，我国的马尾松遗传育种研究取得了丰硕的成果。在种源试验(陈天华等，1994；卢兆银等，2006)、种质资源收集(杨章旗等，2001；黄楚光，2007)、种子园建设管理(郑仁华等，2006；胡集瑞，2007)、木材品质改良(谭健晖，2012；杨章旗，2012)、交配系统分析(张薇等，2009；谭小梅等，2012)、无性繁育技术(张宇等，2006)、遗传图谱构建(尹佟明等，1997；何卫龙等，2014)等方面开展了大量的研究。但是，在马尾松遗传多样性研究方面一直以种子园为主要研究材料(万爱华等，2008；朱必凤等2007；张一等，2009)，关于马尾松天然群体遗传多样性的研究报道较少。

广西是马尾松优良种源的主要分布区，马尾松天然种质资源十分丰富，其中地处十万大山的宁明县桐棉乡是我国最优良的马尾松种源地之一。桐棉种源是通过国家审定的马尾松良种(良种编号：国S-SP-PM-003-2002)。该种源分布面积达1.56万hm2，但近30年来，由于人为因素的影响，广西的马尾松天然资源遭受破坏严重。因人口激增及生产技术滞后等因素的影响，原生天然林已经十分稀少，次生林又因不断遭受负向选择，造成存留的种质群体遗传品质下降(杨章旗等，2001)。根据1994年的调查情况，桐棉种源采种优良林分已经从近10 000 hm2降至700 hm2(杨光登，1995)。为了详实地了解桐棉种源天然种质资源的保存现状，本研究采用SSR分子标记技术对桐棉种源的天然群体进行了遗传结构研究。以期为马尾松天然种质资源的保护和管理提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

2012年9-10月，对宁明县桐棉种源天然群体进行样本采集。桐棉群体材料采自9个地点，分别是广西宁明县桐棉乡的桐棉、琴清、恭敬、吉打、鸡笃、那卜、那梨、那旭，以及那楠乡的驮象。其中，桐棉村及其西南的恭敬、吉打、鸡笃是传统的桐棉种源核心区。每个地点采样单株间距在50 m以上，采样林分林龄在45～50 a之间。采集新鲜针叶采用硅胶干燥保存，共计285个样本。详细信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采用CTAB裂解—硅珠吸附法对马尾松针叶进行DNA提取(Doyle JJ & Doyle JL,1990)。将经过纯化处理后的马尾松DNA进行纯度检测。在4 ℃低温环境下保存。

表 1 桐棉天然群体取样信息

Table 1 Sample information of the Tongmian natural populations

编号No．采样地点Samplinglocation纬度和经度Latitudeandlongitude海拔高度Altitude(m)采样数量(株)Samplingnumber(plant)T⁃TM桐棉乡桐棉村TongmianVillage，TongmianTownship21°48′19．94″N，107°18′31．90″E70034T⁃JDA宁明县桐棉乡吉打村JidaVillage，TongmianTownship21°46′56．88″N，107°15′32．26″E60030T⁃QQ宁明县桐棉乡琴清村QinqingVillage，TongmianTownship21°49′47．47″N，107°17′43．04″E40034T⁃NP宁明县桐棉乡那卜村NabuVillage，TongmianTownship21°53′55．14″N，107°16′6．04″E65034T⁃NX宁明县桐棉乡那旭村NaxuVillage，TongmianTownship21°46′40．24″N，107°19′19．28″E45030T⁃NL宁明县桐棉乡那梨村NaliVillage，TongmianTownship21°43′49．57″N，107°23′22．41″E65033T⁃JDU宁明县桐棉乡鸡笃村JiduVillage，TongmianTownship21°48′39．19″N，107°16′45．51″E50030T⁃GJ宁明县桐棉乡恭敬村GongjingVillage，TongmianTownship21°45′56．38″N，107°17′12．76″E80030T⁃TX宁明县那楠乡驮象村TuoxiangVillage，Na’nanTownship21°59′21．59″N，107°28′57．53″E45030

图 1 引物 PF463扩增桐棉群体的SSR产物电泳图Fig. 1 Electrophoresis of SSR fragments amplified with primer PF463 for Tongmian populations

图 2 桐棉天然群体采样地点分布示意图Fig. 2 Sampling location distribution of Tongmian natural populations

1.2.2 PCR反应与PAGE胶电泳检测 根据马尾松基因组DNA测序结果开发SSR 引物，共计506对(Feng et al,2013)。从中筛选出16对多态性较高的用于天然群体遗传多样性研究(图1)。所用引物由上海捷瑞基因技术有限公司合成，Taq酶、dNTPs购自捷瑞生物工程公司。采用10 μL 体系进行PCR反应，参照Feng et al(2013)在SSR引物开发时所用的PCR反应体系进行实验。将得到扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，实验方法参照杨章旗(2014)在细叶云南松研究中所用的方法。

1.2.3 SSR位点判读分析 将显影后的凝胶置于白光显影灯上成像，使用数码相机拍照。以50 bp DNA Ladder为参照进行带型判读，按条带分子量大小用A，B，C，D，E，…，依次编号。

1.2.4 遗传多样性分析 采用POPGENE32软件(Yeh et al,1997)计算以下遗传参数：(1)多态位点百分率(Percentage of polymorphic loci，PPB)；(2)观测等位基因数目(Observed number of alleles，Na)；(3)有效等位基因数目 (Effective number of alleles，Ne)(Hartl et al,1989)；(4)Shannon多样性指数(Shannon’s information index，I) (Shannon et al,1949)；(5)观测杂合度(Observed heterozygosity，Ho)；(6)期望杂合度(Expected heterozygosity，He) (Nei et al,1973)；(7)Wright固定指数(Fixation Index，F) ，由公式1-FIT=(1-FIS)(1-FST)分别得出FIS、FIT和FST(Wright et al,1973)；(8)总群体遗传多样性(Ht)；(9)群体内的平均遗传多样性(Hs)；(10)群体间的平均遗传多样性(Dst，Dst=Ht-Hs)；(11)遗传分化系数(GST,GST=(Ht-Hs) /Ht)；(12)Nei’s 标准遗传距离(Genetic distance，GD)(Nei et al,1972)；(13)基因流(Gene flow，Nm)(Slatkin et al,1989)。

2 结果与分析

桐棉种源天然林面积很大，为较为全面了解其遗传结构，采用16对SSR引物对天然群体的总体遗传多样性及9个采样林分的遗传多样性进行分析。

2.1 马尾松桐棉天然群体的总体遗传多样性

16对 SSR 引物在桐棉群体的285 个样本中共检测到 53个等位基因。多态位点百分率为100%。每个位点观察等位基因数(Na)为2～5个，平均为 3.31；有效等位基因数(Ne)为1.18～2.7，平均有效等位基因数1.68(表2)。

不同位点的多样性参数差别很大，Shannon 多样性指数(I)最高为 1.05，最低为 0.31，平均为0.64。观测杂合度(Ho)变化范围为 0.16～0.79，平均为0.35；期望杂合度(He)变化范围为 0.15 到 0.63，平均为 0.36(表2)。

2.2 马尾松桐棉种源不同群体的遗传多样性

在 9个林分中，T-NP的观测等位基因数(Na)最高(2.69)，T-JDU最低(2.25)。T-TX有效等位基因数(Ne)最高(1.77)，T-TM最低(1.48)。Shannon多样性指数(I)最高为T-TX (0.64)， 最低为T-JDU(0.71)。在杂合度上，不论是观测杂合度(Ho)还是期望杂合度(He)都以T-TX为最高，T-JDU为最低。

表 2 TM-A天然群体 16 个 SSR 位点的遗传多样度

Table 2 Genetic diversity of 16 SSR loci within Tongmian natural populations ofP.massonian

位点Locus观察等位基因数Na有效等位基因数NeShannon信息指数I观测杂合度Ho观测杂合度HePJ23941．660．650．190．40PJ24731．510．600．250．34PF32221．460．490．390．31PF40242．441．050．340．59PF40851．610．700．440．38PF46351．740．810．230．42PF56941．410．550．310．29PF61541．240．430．210．19PF62031．650．690．490．39PF64831．380．470．320．27PF65332．701．040．790．63PF72731．200．340．180．17PF74221．340．420．290．25PF76431．180．310．160．15PF78432．651．030．450．62PF79321．690．600．570．41平均Mean3．311．680．640．350．36

从表3和图2可以发现，处于桐棉种源核心区域的T-GJ、T-JDA、T-JDU、T-TM这4个林分体在前5项指标上平均水平低于处于核心区外围的T-NL、T-NP、T-NX、T-QQ与T-TX这5个林分。通过统计分析可知，处于核心区域的4个林分与外围的5个林分在观测等位基因数(Na)与观测杂合度(Ho)上存在显著差异(α<0.05)，在有效等位基因数(Ne)、Shannon多样性指数(I)与期望杂合度(He)上存在极显著差异(α<0.01)。而期望杂合度(He)也被称为基因多样性(Genetic diversity)，其与Shannon多样性指数是评价遗传多样性最常用的指标。这两项指标表明，外围的5个林分具有更高的遗传多样性。

Wright固定指数用来指示取样种群是否偏离Hardy-Weinberg平衡，存在杂合子的过多或者缺乏。一般FIS值越接近于零，说明基因型分布越接近于平衡状态；FIS值越偏离零，基因型分布越偏离平衡状态。FIS值为正说明杂合子缺失，FIS值为负说明杂合子过剩。从所得到的FIS值可以看出，所有群体的固定指数的绝对值都小于0.1，基因型分布接近于平衡状态，未出现明显的杂合子过剩或不足。

2.3 桐棉马尾松群体间遗传分化

根据之前的分析数据得出，桐棉群体的总遗传多样性(HT)为0.36，林分内平均遗传多样性(HS)为0.35，林分间平均遗传多样性(Dst)为0.019，遗传分化系数(GST)为0.049，即林分间的遗传变异占总变异的4.9%。而根据F-statistic得出的16个位点FST平均值为0.072。两者都显示桐棉马尾松的遗传多样性主要存在于林分内，林分间不存在明显的遗传分化。桐棉天然群体的基因流(Nm)大小为3.21(表4)。

表 3 9个采样林分天然群体遗传多样性

Table 3 Genetic diversity among nine natural populations

群体Population观察等位基因数Na有效等位基因数NeShannon信息指数I观测杂合度Ho期望杂合度He固定指数FIST⁃GJ2．561．630．540．330．32-0．049T⁃JDA2．441．550．530．370．33-0．073T⁃JDU2．251．530．460．230．280．09T⁃TM2．441．480．470．270．280．019T⁃NP2．691．720．610．370．37-0．055T⁃NX2．631．690．60．40．37-0．064T⁃NL2．631．720．620．40．38-0．079T⁃QQ2．561．740．610．370．37-0．045T⁃TX2．631．770．640．420．4-0．035平均Mean2．531．650．560．350．34-0．032

3 讨论与结论

3.1 马尾松桐棉群体遗传多样性

马尾松是广西境内分布面积最大的树种。在漫长进化的过程中，为了适应广西复杂多样的自然地理环境，马尾松的天然群体积累了丰富的遗传变异。根据本研究的分析结果，可知桐棉马尾松天然群体的Shannon 多样性指数(I)为 0.64，观测杂合度(Ho)为 0.35， 期望杂合度(He)为 0.36，Wright固定指数 (FIS)-0.032。这一结果高于丁小飞等(2006)用同工酶方法对湖北马尾松天然群体的研究结果(He=0.262)，在一定程度上说明广西是马尾松遗传资源较为丰富的地区。李志辉等(2009)曾对广西马尾松另外两个优良种源古蓬群体与浪水群体进行遗传多样性分析，得出古蓬群体(I)为0.4278；浪水群体Shannon信息指数(I)为0.5190。与之相比，桐棉群体在广西3个优良种源中遗传多样性最高。三者中，桐棉群体的分布面积最大、实验群体样本量最多、保存情况也最好，因此具有较高的遗传多样性。

表 4 桐棉群体的 F统计量和基因流

Table 4 Fs-statistic and gene flow of Tongmian populations

位点Locus亚群内近交系数FIS总体近交系数FIT亚群间近交系数FST基因流Nm2390．4850．5250．0763．0222470．2340．2730．0514．640322-0．309-0．2380．0544．3804020．3940．4310．0603．892408-0．233-0．1580．0613．8724630．3780．4550．1241．761569-0．238-0．0720．1351．605615-0．186-0．0800．0892．557620-0．629-0．2610．2260．857648-0．202-0．1870．01220．665653-0．344-0．2640．0593．961727-0．124-0．0900．0307．993742-0．166-0．1370．0259．955764-0．094-0．0770．01615．8537840．2420．2830．0554．282793-0．435-0．3970．0269．228平均Mean-0．0390．0360．0723．210

3.2 马尾松桐棉群体遗传结构

本研究结果已经证明广西马尾松天然群体受到了较大的人为活动干扰。强烈的人为干扰将破坏物种原始生境，甚至造成生境片段化，破坏群体的遗传结构使群体发生分化(Epperson et al,1989)。本研究对桐棉群体9个林分材料的研究表明，该群体的遗传分化系数(GST)为0.049，FST平均值为0.072。两者都显示桐棉群体的遗传多样性主要存在于林分内，林分间不存在明显的遗传分化。桐棉群体的基因流(Nm)大小为3.21。这说明虽然遭到人为干扰，但桐棉种源天然群体的遗传结构并未遭受严重破坏，不同地点林分间基因交流通畅。同时研究结果显示所有林分固定指数的绝对值都小于0.1。说明桐棉群体的基因型分布接近于平衡状态，没有出现明显的杂合子过剩或不足。但研究也发现处于桐棉种源核心区域的4个林分体在Shannon 多样性指数(I)和期望杂合度(He)两项指标上均低于平均水平。而处于核心区外围的3个林分的遗传多样性较高。这说明桐棉种源核心区域遭到的人为破坏比周边地区更为严重。

3.3 群体内遗传多样性与自然遗传改良

目前广西马尾松的人工遗传改良已经进入到高世代改良阶段，通过人为选择获得显著的遗传增益，在全区建立了多个1.5代及第2代种子园，保障了生产性良种的供给。但在未来马尾松的利用研究中如何继续天然林资源是一个值得育种研究者与森林资源主管部门深入思考的问题。本研究发现马尾松桐棉种源的遗传多样主要存在于林分内。这表明马尾松林分内蕴含着丰富的遗传变异。在自然再生系统下，林分也能通过留下最具有亲本植株优良性状的子代，尤其是具有速生优势和高抗逆性的子代在自然选择中更容易存活。因此，林业工作者不应忽视通过自然更新，从遗传上提高林分价值的潜力。但是林分内丰富的遗传变异也为“拔大毛”式的负向选择提供了“机遇”。最好的树木遭到采伐后，最差的树则被保留下进行林分重建将严重降低林分及其后代的遗传品质。本研究中已经发现桐棉种源的核心区遭到严重人为干扰。所以，为了让广西丰富的马尾松资源在自然条件下得以正常更新与改良，应重视对马尾松天然林的科学管护。

3.4 广西马尾松天然遗传资源的保护

历史上，广西先民早有栽种、经营松林的习惯。在20世纪50年代以后，广西的马尾松人工林发展速度很快。到1980年时，马尾松人工林的总面积已占全区森林优势树种总面积的56.2%，占总蓄积量的33.69%(李治基，2001)。从而一跃成为广西森林面积最大的树种，并一直延至今日。但人工林快速发展的表象却掩盖了马尾松天然遗传资源被不断蚕食的严峻现实。为此，作者建议应该尽快制定出保护马尾松天然遗传资源的有效策略。一方面结合遗传资源的选择收集，异地建立大规模种质资源库。另一方面，对于桐棉种源这类分布面积大、利用价值高、目前所受破坏尚不严重的天然群体，应建立专门的自然保护区，严禁盗伐、主伐、非法采割松脂及过度采种。

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Genetic structure ofPinnusmassonianaon Tongmian natural populations in Guangxi

FENG Yuan-Heng1,2, LI Huo-Gen2, YANG Zhang-Qi1*,WU Dong-Shan1

( 1.GuangxiInstituteofForestryScience， Nanning 530002， China; 2.KeyLabofForestGeneticsandBiotechnology,NanjingForestryUniversity,MinistryofEducation, Nanjing 210037, China )

Guangxi Tongmian is an important superior provenance region of masson pine in China. The distribution area of this provenance had reached 15 600 hm2. It had a high-quality and rich genetic resources of masson pine, and made a great contribution to the genetic improvement of masson pine. Over the last 30 years, natural resources of masson pine in this region have suffered serious damage. To understand the genetic diversity of natural germplasm resources of masson pine in this area, SSR molecular markers were used to analyze the population genetic structure of masson pine in Tongmian region. The results showed that 53 alleles were identified by 16 pairs of SSR primers in 285 samples, and the polymorphism rate was 100%. The mean number of alleles (Na), the mean number of effective alleles (Ne), Shannon’s information index (I), observed heterozygosity (Ho), expected heterozygosity (He) were 3.31, 1.68, 0.64, 0.35 and 0.36. This showed that the Tongmian population still maintained high level of genetic diversity. Analysis on genetic structure of each stand in Tongmian population showed that coefficient of genetic differentiation (GST), fixation index (FST) and gene flow(Nm) were 0.049, 0.072 and 3.21. The genotype distribution was closer to Hardy-Weinberg equilibrium, and had no significant heterozygote excess or shortage. In Tongmian population, most genetic variation mainly existed within the stand, and no significant genetic differentiation existed among stands. The gene flow in it was smooth. Meanwhile, the genetic diversity of the four stands in the core region was lower than genetic diversity of three stands outside the core region. This indicated that the core region of Tongmian provenance suffered more serious man-made damage. In order to protect the natural updating and natural genetic improvement ability of the natural populations of masson pine in this area, we should pay attention to the scientific management of natural forest. On the one hand, genetic resources should be collected and large-scale germplasm resources should be established. On the other hand, we should establish special nature reserve and prohibit illegal felling, final felling, illegal resin tapping and excessive seeding for the natural population like Tongmian which has large distribution area, high utilization value and no serious damage at present. The results of this study have important reference value for the research and protection of the natural germplasm resources of masson pine.

Pinusmassoniana, natural populations, genetic structure, SSR, provenance

10.11931/guihaia.gxzw201505025

2015-10-08

2016-01-07

广西八桂学者专项；广西优良用材林资源培育重点实验室自主研究课题(12B0102)；广西自然科学基金(2014GXNSFBA118078) [Supported by Guangxi Special Fund for Bagui-Scholar; Guangxi Key Laboratory of Superior Timber Trees Resource Cultivation (12B0102); Guangxi Natural Science Foundation(2014GXNSFBA118078)]。

冯源恒(1981-)，男，黑龙江牡丹江市人，博士，高级工程师，主要从事林木遗传育种研究，(E-mail)nanyuan05@163.com。

*通讯作者： 杨章旗，博士，教授级高级工程师，主要从事林木遗传育种研究，(E-mail)yangzhangqi@163.com。

Q347， S718.46

A

1000-3142(2016)11-1275-08

冯源恒， 李火根， 杨章旗， 等. 马尾松桐棉种源天然群体遗传结构研究 [J]. 广西植物， 2016， 36(11):1275-1281

FENG YH, LI HG, YANG ZQ， et al. Genetic structure ofPinnusmassonianaon Tongmian natural populations in Guangxi [J]. Guihaia， 2016， 36(11):1275-1281