游离DNA异常甲基化在卵巢癌中的研究进展

徐梦娇（综述），童晓文（审校）

1.同济大学医学院，上海 200092；2.同济大学附属同济医院妇产科，上海 200065

游离DNA异常甲基化在卵巢癌中的研究进展

徐梦娇1（综述），童晓文2（审校）

1.同济大学医学院，上海 200092；2.同济大学附属同济医院妇产科，上海 200065

卵巢癌（ovarian cancer）是死亡率较高的妇科恶性肿瘤之一，初期常无症状，多数患者往往在晚期或出现转移后才发现，随着研究的深入，发现其发生、发展、诊治与DNA异常甲基化有密切联系。通过研究DNA甲基化机制，有助于卵巢癌的早期诊断、治疗和预后判断。游离DNA是细胞外游离存在于体液中的DNA，可在肿瘤细胞坏死、凋亡等过程中产生，在卵巢癌的诊治中有着重要的研究意义。本文就DNA异常甲基化在卵巢癌的研究进展及甲基化研究方法做综述。

游离循环DNA；DNA甲基化；卵巢癌；CpG岛

卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤之一，约占女性恶性肿瘤死亡总数的5%[1]。卵巢癌初期常无明显症状，70%的患者发现时已到FIGOⅡB到Ⅳ期，5年生存率仅为15%～45%。而早期诊断明显提高患者5年生存率。临床上，CA125作为血清标志物，对Ⅰ期卵巢癌的检出率仍低于50%[2]，并且，CA125的特异性并不强，很多良性和恶性疾病，如子宫内膜癌、妊娠、盆腔炎症、结肠癌、肺癌等都可能会出现假阳性；阴道超声检查、磁共振成像等传统的诊断方法假阳性率高，特异性低。卵巢癌患者对化疗的敏感性存在个体差异，有些患者经手术、化疗等治疗后复发，其对化疗药物的耐药增加进一步治疗的难度。缺乏用于诊断的特异性的生物标记物和化疗药物的耐药性成为了卵巢癌早期诊断和治疗的主要问题。随着研究的深入，发现卵巢癌的发生、发展、治疗及预后与DNA异常甲基化有着密切的关系。并且DNA甲基化比较稳定，能在血清中检测，未来可以作为一种微创检查方法。

1　游离DNA

游离DNA（cell-free DNA）是细胞外游离存在于体液中的DNA，可由正常细胞或肿瘤细胞产生，目前已在血清、尿液、前列腺液、唾液等体液中检测到。早在1947年，Mandel等[3]就发现在人血浆和血清中存在核酸，并提出“循环核酸”的概念。成年人每天有几十亿细胞通过死亡、凋亡等方式进行消除，这可能就是人血浆和血清中游离DNA的来源（图1）[4]。游离循环DNA的微创检测对人类疾病的诊断、治疗和预后来说，有巨大的潜能和优势[5]。

图1　血浆或血清中的游离DNA的来源大致分为两类：一是肿瘤内游离DNA经侵袭或转移直接进入血液循环中；二是血液中的循环肿瘤细胞凋亡、坏死等释放DNAFig.1 There are twoways for the source of cell-free DNA in serum:one is that cell-free DNA in tumor breaks into the blood circulation directly by invasion ormetastasis;the other is that DNA in tumor cellswhich are in the circulation through apop tosisand necrosis com esout to the b lood circu lation

2　DNA甲基化

DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNMT）作用下，以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶的5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶的过程（图2A）。DNA甲基化通常发生在CpG位点的C上。CpG岛（CpG island）为CpG位点较为密集区域，在人类全基因组中，大约60%的CpG岛位于基因的启动子[6]，并且大多是非甲基化的，可以维持基因转录的活性，而岛外的CpG位点多数是甲基化的，维护基因的稳定[7]，所以DNA甲基化对基因表达起到非常重要的调控作用。

随着对DNA甲基化研究的深入，发现了多种检测方法。其中最早出现的是甲基化敏感性限制性内切酶后PCR或者DNA印迹法，但其对假阳性产物同样敏感，并且需要大量的DNA[8]。

到20世纪90年代中期，出现甲基化特异性PCR，该方法采用重亚硫酸盐处理DNA后，将所有未甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能被转换，利用碱基互补配对原则，通过特异性的引物对样本DNA进行扩增，扩增产物可以经过电泳判断甲基化情况[9]。MSP虽然特异性强，但仍有很多缺点，重亚硫酸盐处理DNA样本时，因为DNA需要长时间暴露在较严苛的环境中，常常引起DNA的裂解[10]。而且硫化过程长达16 h，推迟了观察实验结果的时间，并且不能对甲基化程度定量[11]。

现在很多试剂盒的技术改进，DNA裂解降低，胞嘧啶到尿嘧啶的转换率提高，硫化时间也缩短至4h[12]，定量MSP也应用于基因的甲基化检测。但是，从DNA提取到重亚硫酸盐处理，需要很多步骤，多次转移样本会增加样本污染和损失，尤其血清游离循环DNA含量非常少，所以，仍需要改进技术来保证样本的质和量。

3　DNA异常甲基化在卵巢癌中的研究

在肿瘤的异常DNA甲基化中，主要是两种对立的表观修饰方式，一是致癌基因的低甲基化修饰导致的基因异常高表达，二是抑癌基因的甲基化修饰导致的基因失活（图2B）。

3.1高甲基化与卵巢癌

在肿瘤中，启动子DNA异常的高甲基化是除了基因缺失和突变外，可以导致抑癌基因功能失活的另外一种途径[13]。在卵巢癌中，研究最多的就是经典抑癌基因BRCA 1，该基因有一定的遗传性和散发性，而在散发的卵巢癌中，异常高甲基化是导致非突变BRCA1失活的原因之一[14-15]。而研究发现，相对于Ⅰ期和健康人，处于Ⅱ期和Ⅲ期的上皮性卵巢癌病例中，BRCA1启动子明显呈高甲基化状态[16]。在基因错配修复相关基因中，有研究发现，hMLH1启动子高甲基化占卵巢癌的56%，而hMSH2启动子高甲基化占57%，且两个基因表达明显降低[17]。其他基因如RASSF1A及相关的OPCML等基因也被发现高甲基化[18]，细胞黏附相关基因H-cadherin和CDH1也有相似结果[19]。可见，高甲基化导致的抑癌相关基因失活与卵巢癌的发生和发展有着密切的联系。

3.2低甲基化与卵巢癌

二是基于产城布局确定校址。职业教育是与产业紧密结合的教育种类，“产教融合、校企合作”是基本要求。根据现代城市建设、经济发展、产业转型升级的先进做法看，产城教融合是未来新型城市发展的典型模式，一个重要做法就是把职业学校建立在产城融合的“新城镇”，实现“宜居”“宜产”“宜教”，这在江苏、贵州等地得到了良好印证。云阳县结合大数据产业园建设，计划将县职教中心整体搬迁至水口工业园区，进行全新规划建设，打造“产教融合、校企合作”的示范。

DNA低甲基化最早被发现是与染色体不稳定、印记缺失有关[20]。在人恶性肿瘤中，DNA低甲基化常发生在DNA重复序列和卫星DNA，近期的研究证明，这些低甲基化的重复序列可能是转座因子，散布在全基因，并且使基因组不稳定[21]。然而直到现在，仍不能确定低甲基化是否能再激活恶性肿瘤中因高甲基化而沉默的基因。但至少在一些癌症相关报道中，编码区及非编码区存在低甲基化。

有研究显示，卵巢癌中卫星2（Sat2）的DNA存在低甲基化，与正常卵巢组织相比，1号染色体Sat2低甲基化在卵巢癌中，与疾病分期和肿瘤级别显著相关[22]。

图2　 A：在DNA甲基化转移酶（DNM T）作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶的5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶；B：甲基化与基因表达的关系，甲基基团为甲基结合蛋白提供靶向位点，使其通过募集组蛋白去乙酰氨基酶等协阻抑物实现转录抑制Fig.2 A：show s reactionsusing S-adenosyl-m ethionine (SAM)asam ethyldonor and catalyzed by enzymes called DNAmethyltransferases(DNMT)add amethylgroup to the cytosine ring to form m ethyl cytosine;B：show s the relationship between themethylation of promoter and the gene expression.M ethylation of promoters inhibits their recognition by transcrip tion factorsand RNA polym erase, asm ethylated cytosine binding protein,or M eCP.W hen a promoter region normally recognized by an activating transcrip tion factor,ism ethylated,its transcrip tion is inhibited

4　游离DNA异常甲基化在卵巢癌中的研究

4.1卵巢癌诊断相关

现在卵巢癌的诊断仍依赖于CA125等肿瘤标志物的检测，确诊仍需活体组织病理学检查，但确诊时往往已经到了晚期。最新研究发现，在卵巢癌形成初期常出现DNA甲基化异常，较其表达产物早，且早于其他标志物出现，并可在血清、腹腔液体等体液中检测到。虽然很多研究报道是关于卵巢癌异常甲基化的，但很少有报道是关于卵巢癌血清中的DNA异常甲基化。Caceres等[23]发现在卵巢癌血清DNA样本中，RASSF1A和BRCA1启动子甲基化的阳性率分别为25/50（50%）和9/50（18%），阴性对照为20例，由于阴性对照数量较少，所以不能得出精确的特异性。但Liggett等[24]收集30位卵巢癌患者、30位卵巢良性疾病患者及30位健康人的病例，联合检测血清DNA中RASSF1A、CACLA、EP300的高甲基化情况，与健康人相比，卵巢癌患者的敏感性为90%，特异性为87%；与卵巢良性疾病患者，卵巢癌患者RASSF1A和PGR联合检测的敏感性为80%，特异性为73.3%。越来越多的研究展示游离DNA异常甲基化作为卵巢癌检测的巨大潜能，但从实验应用到临床还有很长的路，因为缺乏精准又经济的检测技术和检测标准。

4.2卵巢癌治疗相关

化疗药物抵抗目前是提高卵巢癌患者生存率的主要障碍，尤其是复发性卵巢癌。多数化疗药物作用是依靠诱导凋亡，故肿瘤细胞常常通过下调凋亡基因，或高表达抗凋亡基因来获得化疗抵抗性。基因突变、缺失或等位基因的丢失是不可逆的，但表观异常是可以改变的。Su等[25]研究发现，在卵巢癌中，高甲基化沉默Wnt通路中的SFRP5与铂类化疗药物抵抗性有关，相似的研究里，hHMLA1、精氨酸生物合成相关基因ASS1和ESR2也与铂类药物抵抗相关[26]。有研究表明HSulf-1的表达可以影响化疗反应，通过使HSulf-1启动子高甲基化致其表达下调后，可导致顺铂对肿瘤细胞的杀伤作用下降，在卵巢癌细胞株OV167和OV202中，HSulf-1高表达者化疗反应率能达到90%，而低表达者约63%[27]。DNA甲基化与基转移酶（DNMT）的活性相关，将核酸类似物加入到快速生长的肿瘤细胞中，当DNA复制时，其可通过抑制甲基化转移酶的活性，从而降低抑癌基因启动子的甲基化，增加抑癌基因的表达[28]，研究显示获得性铂类抵抗卵巢癌中可以观察到DNMT上调，表明异常的甲基化与DNMT活性增长相关。

异常的DNA甲基化与肿瘤的发生、发展密切相关，在诊断和治疗方面有一定的价值，在判断患者预后也有潜力。单基因甲基化检测缺乏特异性，多基因甲基化检测可增加特异性和敏感性，Su等[30]收集卵巢癌患者血清游离DNA对SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5、SOX1、PAX1和LMX1A七个基因进行甲基化检测，结果显示其结果与患者的化疗效果及复发、总体生存率相关。研究表明，游离DNA甲基化可以用于判断预后，有很好的研究前景。

Pattamadilok等[31]在研究中发现，在卵巢癌组织中，LINE-1的重复序列的DNA低甲基化与其组织分型、肿瘤分级和病理分期（FIGO）相关，当LINE-1甲基化水平低时，其总体生存率降低，预后较差，但暂时没有关于游离DNA低甲基化与卵巢预后关系的研究。

5　结语

由于卵巢癌早期，患者常无特殊临床表现，因此早期诊断对于治疗和提高生存率尤为重要，同时，化疗药物的耐药性依然是治疗过程中的重大难题，所以寻找新的生物标记物和增加化疗药物敏感性成为了研究热点，上述各项研究表明游离循环DNA异常甲基化可以通过血清、腹腔积液等体液检测到，未来可能成为卵巢癌微创检测新方法。而其对治疗和预后的判断可以帮助实现肿瘤的个体化治疗。虽然表观遗传学在卵巢癌的研究中获得了很大的进步，但目前仍需寻找卵巢癌相关的高特异性的异常甲基化的基因，研究更为高效、微创的检测方法，使得卵巢癌的筛查和诊断更简便、有效、准确，并更加广泛地应用于临床检测。

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Research p rogressof aberrantcell-free DNAmethylation in ovarian cancer

XU Mengjiao1，TONG Xiaowen2
1.TongjiUniversity SchoolofMedicine，Shanghai200092，China；2.DepartmentofObstetricsand Gynecology，TongjiHospital，TongjiUniversity School of Medicine，Shanghai 200065，China

Ovarian cancer is one of themost common malignant tumors in gynecology.In early stage，there is usually no symptom.Most patients are diagnosed in a later stage or aftermetastasis.It has been revealed that the onset，development，diagnosis and treatment of ovarian cancer are closely related to the aberrant DNA methylation.The research on the mechanism of DNA methylation maycontribute to the early diagnosis，treatment and prognosis prediction of ovarian cancer.Cell-free DNA comes from tumor cellnecrosis and apoptosis，and plays an important role in the research of diagnosis and treatment of ovarian cancer.The research progress of aberrant DNA methylation in ovarian cancer is reviewed in this paper.

Cell-free DNA；DNAmethylation；Ovarian cancer；CpG island

R711.7

A

2095-378X（2016）02-0132-04

10.3969/j.issn.2095-378X.2016.02.017

徐梦娇（1990—），女，在读硕士研究生，研究妇科肿瘤

童晓文，电子信箱：xiaowen_tong@yahoo.com

（2016-03-21）

（2016-01-22）