窦雪丽,陈晓晖,杨幸怡,刘 宏,刘 超,*
(1.广东省汕头市公安局,广东 汕头 515011;
2.广州市刑事科学技术研究所,广东省法医遗传学重点实验室,广州 510030)
3个Y-STR分型体系的法医学应用比较
窦雪丽1,陈晓晖2,杨幸怡2,刘 宏2,刘 超2,*
(1.广东省汕头市公安局,广东 汕头 515011;
2.广州市刑事科学技术研究所,广东省法医遗传学重点实验室,广州 510030)
目的 评估GFS24Y STR、PowerPlex®Y23System及AGCU24Y STR 3个体系的法医学应用价值。方法 从群体多态性、分型准确性、灵敏度、种属特异性、组织同一性、性别特异性、混合样本检验等方面进行检测评估。结果 对137例广东男性无关个体进行检测,3个Y-STR复合扩增体系均检出137种唯一单倍型,PowerPlex®Y23System共发现139个等位基因,AGCU24Y STR共发现145个等位基因,GFS24Y STR共发现154个等位基因;AGCU24Y STR、GFS24Y STR检测体系灵敏度均为0.125 ng,PowerPlex®Y23 体系为0.0625 ng。结论 PowerPlex®Y23System、AGCU24Y STR、GFS24Y STR 3个体系在广东人群中均有高度多态性,灵敏度、种属特异性、组织同一性、性别特异性、混合样本检测等方面均可满足法医实际检案要求,在父系鉴定、个体识别、群体遗传等方面具有良好的应用前景。
Y-STR;荧光复合扩增;多态性;法医遗传学;单倍型
人类Y染色体属正常男性特有,除拟常染区外,在遗传过程中不发生重组。理论上除突变外,同一父系Y-STR遗传标记拥有相同的单倍型,在混合检材检验和父系鉴定等方面具有独特的应用价值[1]。目前,Y-fi ler和PowerPlex®Y23等商业化试剂盒已在法医DNA检验中被广泛应用,但这些试剂盒所含的基因座基本相同,即使联合应用,也难以大幅提升总识别力。同时,由于地域、种族间的差异性,国外试剂盒中所包含的一些Y-STR基因座在我国群体中的遗传多态性相对较差,个体识别力相对较低,不能满足国内法医学应用的需要[2-3]。因此,建立适合我国人群的、包含更多多态性基因座的Y-STR荧光检测体系十分必要。
本研究将国产的GFS24Y STR及AGCU24Y STR检测系统与美国Promega公司的PowerPlex®Y23System进行法医学应用效果比较研究,为法医学实践、群体遗传学研究选用适合的系统提供参考。
1.1 Y-STR基因座的群体遗传学调查
137名广东汉族无关男性个体血样,由广州市刑事科学研究所日常案件中随机抽取,使用TECAN freedom EVO-150自动化工作站,提取基因组DNA,4 ℃保存待用。样本DNA按照3个检测体系提供的说明书进行PCR扩增,产物采用ABI 3130XL遗传分析仪电泳,使用GeneMapper V3.2进行数据分析。
1.2 灵敏度检测
分别使用1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 ng的男性DNA标准品9948作为模板,在同一台ABI 9700扩增仪上,按照各试剂盒建议的扩增条件,分别进行GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex®Y23System 3个复合扩增体系的检测。
1.3 种属特异性检测
使用兔、鱼、鸡、牛、羊、鸭、驴、狗、鼠、猪、猴、鸽子的基因组DNA样本分别进行GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex®Y23System 3个复合扩增体系的检测。
1.4 混合成分检测
1.4.1 男女混合,男性成分保持不变
PCR反应体积为25 μL。Control DNA 2800M男性标准品,其成分保持在0.5 ng不变,高浓度女性DNA浓度为221 μg/mL。2800M与高浓度女性DNA分 别 以1:1000、1:2000、1:4000、1:6000混 合, 用GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex®Y23System 3个体系进行平行检测。
1.4.2 女男混合,女性成分保持不变
PCR反应体积为25 μL。Control DNA 2800M与高浓度女性DNA(高浓度DNA保持400ng不变)混合,Control DNA 2800M的浓度依次为0.5、0.25、0.125、 0.0625、0.03125 ng进行混合的样本,样本分别用GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex®Y23System 3个体系进行平行检测。
1.4.3 男男混合
Control DNA2800M男性标准品为样本1,Control DNA9948男性标准品为样本2,DNA模板量为1ng不变,样本1和样本2分别以1:1、1:3、1:9和1:19的比例混合,用GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex®Y23 System 3个体系进行平行检测。
1.5 男性特异性检测
对广州市刑事科学研究所日常案件中随机抽取的5例男性与5例女性样本模板进行GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex®Y23 System 3个复合检测体系扩增,扩增产物经3130XL基因分析仪检测。
1.6 组织同一性检测
取同一男性尸体的肌肉组织、骨组织、肋软骨、指甲、皮肤、肝脏、血痕等样本(由广州市刑事科学技术研究所提供)的基因组DNA各1 ng,分别使用GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex®Y23System进行检测。
1.7 统计分析
等位基因频率和单倍型用计数法直接计算并统计,Pi为等位基因频率,即第i个等位基因的频率Pi=第i个等位基因频数/ n(n为实验检测样本数)。基因多样性(gene diversity,GD)按公式GD=n(1-∑Pi2)/(n-1)计算,n为实验检测样本数[4]。
2.1 一致性检测结果
3个体系检测137名广东汉族无关男性个体的Y-STR,PowerPlex®Y23 System和GFS24Y STR两个体系共有5个基因座相同:DYS385 a/b、DYS635、DYS481 和DYS570;AGCU24Y STR和GFS24Y STR两个体系共有8个基因座相同:DYS449、DYS635、DYS527a/b、DYS522、DYS385a/b和DYS444;PowerPlex®Y23 System和AGCU24Y STR两个体系共有17个基因座相同:DYS19、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385 a/ b、DYS438、DYS439、DYS437、DYS448、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4和DYS458。3个体系中所有相同基因座分型结果完全相同。
2.2 灵敏度检测结果
GFS24Y STR、AGCU24Y STR复合扩增系统在模板量0.125 ng~1 ng之间时,可以获得24个Y-STR基因座完整的分型结果,扩增均衡性、峰高符合要求,灵敏度为0.125 ng,当模板量为0.0625 ng时出现基因座漏扩现象。PowerPlex®Y23 System复合扩增系统在模板量0.0625 ng~1ng的情况下可以获得24个Y-STR基因座完整的分型结果,灵敏度为0.0625 ng,当模板量为0.03125 ng时出现基因座漏扩现象。
2.3 种属特异性检测结果
分别使用GFS24Y STR、AGCU24Y STR、Power-Plex®Y23 System 3个复合扩增体系对兔、鱼、鸡、牛、羊、鸭、驴、狗、鼠、猪、猴、鸽子的DNA样本进行检测,均未检测出扩增片段。
2.4 混合样本检测结果
2.4.1 男女混合,男性成分保持不变
Control DNA2800M男性标准品和高浓度女性DNA混合比例大于1:1000时,GFS24Y STR、AGCU24Y STR体系的Y-STR分型均受到女性成分的干扰,而PowerPlex®Y23体系不受女性成分的干扰。
2.4.2 女男混合,女性成分保持不变
在女性成分保持不变(400 ng)的情况下,减少Control DNA2800M男性标准品的量,结果显示:Control DNA2800M男性标准品的量小于0.5 ng时,GFS24Y STR、AGCU24Y STR出现基因丢失,而PowerPlex®Y23 System不受影响(见图1~3)。
2.4.3 男男混合
对Control DNA2800M男性标准品和Control DNA9948男性标准品混合比例分别为1:1、1:3、1:9、1:19的样本分别用GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex®Y23 System 3个 体系进行平行检测,结果显示:Control DNA2800M男性标准品和Control DNA9948男性标准品混合比例高于1:9时,GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex®Y23 System 3个体系均出现含量较少的男性个体基因座基因丢失的现象(见图4~6)。
2.5 男性特异性检测
对5例男性与5例女性样本模板进行GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex®Y23 System 3个复合检测体系扩增,扩增产物经3130XL基因分析仪检测,女性样本未检测到产物峰。同样方法检测的5例男性样本,电泳结果显示各Y-STR基因座均获得检测峰。表明系统检测的Y-STR位点在X染色体上没有同源序列,为男性特异的遗传标记。
2.6 组织同一性的比较
对来源于同一个男性尸体上的肌肉、皮肤、肝脏、指甲、软骨、血痕等进行3个系统检测,分型均一致。说明同一个体系统所检测的Y-STR具有组织同一性。
2.7 遗传多态性检测
图1 AGCU24Y电泳图谱Fig.1 The electrophoretogram of AGCU 24Y
图2 GFS24Y STR电泳图谱Fig.2 The electrophoretogram of GFS 24Y
图3 PowerPlex®Y23电泳图谱Fig.3 The electrophoretogram of PowerPlex®Y23
应 用 GFS24Y STR、AGCU24Y STR、Power-Plex®Y23 System 3个体系对137例广东男性无关个体进行检测,3个Y-STR复合扩增体系单独均检出不同单倍型,每个体系的单倍型各有137种。由PowerPlex®Y23 System扩增体系的23个Y-STR基因座在广东汉族群体共检出139个等位基因,GD值为0.4428~0.9623,其中GD值小于0.7的基因座有8个,分别为DYS448、DYS549、DYS389I、DYS392、DYS533、DYS456、DYS393、Y-GATA-H4, 占34.7 %,GD值小于0.4的基因座有3个(DYS391、DYS437、DYS438);AGCU24Y 扩增体系的24个Y-STR基因座在广东汉族群体中共检出145个等位基因,GD值为0.428~0.9623,其中GD值小于0.7的基因座有8个,分 别 为DYS448、DYS444、DYS522、DYS392、DYS389I、DYS456、DYS393、Y-GATA-H4,占33.3 %,GD值小于0.4的基因座有4个(DYS391、DYS437、DYS438、DYS388);GFS24Y扩 增 体系的24个Y-STR基因座在广东汉族群体中共检出154个等位基因,GD值为0.3137~0.9623,其中GD值小于0.7的基因座有7个,分别为DY557、DYS444、DY552、DYS522、DY520、DY443、DYS460, 占 29.1%,GD值小于0.4的基因座有2个(DYS531、DYS459)(见表1)。
Y染色体STR具有单倍型遗传、父系遗传及男性特有等特征,可在法医学个体识别、混合斑男性成分检测、父权鉴定、亲缘搜索、家系排查等中应用[1-3]。随着国内外学者对不同人群进行的遗传学研究,发现Y-STR的多态性分布在种族、民族、地域和家族等方面有明显的差异。其在研究人类的起源进化、迁移发展和群体分布等方面以独特的优势发挥着重要作用[5-6]。
目前,虽然有包括Y-fi ler和PowerPlex®Y23等商业化试剂盒可供选择,但在法医实践中,由于有些Y-STR在我国人群中个体识别力较低,加之Y-STR突变率较高,在利用Y-STR基因座进行父权鉴定时,3个以上的基因座不同才能排除父权关系[7]。遇到父系关系比较近的男性、微量男男混合检材个体识别等案件时,需要增加检测Y-STR基因座的数目,或同时检测多个Y-STR荧光复合扩增体系,使结论更加可靠。
本研究通过对GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex®Y23 System等3个扩增体系比较,发现3个体系的灵敏度、种属特异性、组织同一性、性别特异性、混合样本检测等方面均可满足法医实际检案要求。但PowerPlex®Y23 System的灵敏度及抗女性成分干扰能力优于GFS24Y STR、AGCU24Y STR,建议在对现场检材尤其是微量污染检材检验时优先选择PowerPlex®Y23系统。
图4 GFS24Y STR 检测混合比为1:9的电泳图谱Fig.4 Electrophoretogram by GFS24Y system to detect the mixed sample of a ratio of 1(male1):9 (male2)
图5 AGCU24Y STR检测混合比为1:9的电泳图谱Fig.5 Electrophoretogram by AGCU24Y system to detect the mixed sample of a ratio of 1 (male1):9 (male2)
图6 PowerPlex®Y23检测混合比为1:9的电泳图谱Fig.6 Electrophoretogram by PowerPlex®Y23 system to detect the mixed sample of a ratio of 1 (male1):9 (male2)
对137例广东男性无关个体进行检测,发现3个Y-STR复合扩增体系均检出不同单倍型,即每个体系的单倍型各有137种。但GFS24Y STR、AGCU24Y STR检出的等位基因数高于PowerPlex®Y23,与文献报道一致[2-3]。为提高应用效能,需要同时检测多个Y-STR荧光复合扩增体系时,联合应用GFS24Y STR与AGCU24Y STR扩增体系或联合应用GFS24Y与PowerPlex®Y23扩增体系。实际应用时,可根据检材和案件需求等具体情况选择合适的Y-STR检测系统。
表1 3个检测体系43个Y-STR基因座GD及等位基因个数(n=137)Table 1 GD value of 43 Y-STR loci and the number of alleles in 137 Guangdong unrelated male individuals detected by three Y-STR typing systems
[1] Kayser M, Kittler R, Erler A, et al. A comprehensive survey of human Y-chromosomal microsatellites[J]. Am J Hum Genet, 2004,74(6):1183-1197.
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Forensic Comparison of Three Y – STR Typing Systems
DOU Xueli1, CHEN Xiaohui2, YANG Xingyi2, LIU Hong2, LIU Chao2
(1. Shantou Public Security Bureau, Guangdong, Shantou 515000, China;
2. Guangzhou Institute of Criminal Science and Technology, Guangzhou 510030,China)
Objective To assess the forensic value of three systems of GFS24Y STR, PowerPlex®Y23 and AGCU24Y STR. Methods The evaluation was targeted at group polymorphism, classifi cation accuracy, sensitivity, species specifi city, organization identity, gender specifi city and detectivity for mixed samples. Results Of the 137 Guangdong unrelated male individuals, 139, 145 and 154 alleles were respectively detected by PowerPlex®Y23, AGCU24Y STR and GFS24Y STR although all the three Y - STR composite amplifi cation systems were detected 137 kinds of sole haploid type. The sensitivities of the three Y-STR systems are 0.0625 ng for PowerPlex®Y23, both 0.125 ng for GFS 24Y and AGCU24Y. Conclusion The three systems of PowerPlex®Y23, AGCU24Y STR and GFS24Y STR, all of high sensitivity and strong specifi city, reveal the high polymorphism in the Guangdong population. The combination of the PowerPlex®Y23, AGCU24Y STR and GFS24Y STR should have good prospect for application in fatherhood identifi cation as well as population genetic analysis.
Y-STR; fl uorescent composite amplifi cation; polymorphism; forensic genetics; haplotype
DF795.2
B
1008-3650(2016)05-0405-05
2016-01-16
格式:窦雪丽,陈晓晖,杨幸怡,等. 3个Y-STR分型体系的法医学应用比较[J]. 刑事技术,2016, 41(5):405-409.
10.16467/j.1008-3650.2016.05.015
广东省科技计划项目(2013B021500010);公安部应用创新计划项目(2011YYCXGDST076)
窦雪丽(1980—),女,山西河曲人,硕士,主检法医师,研究方向为法医物证学。E-mail:108703466@qq.com
* 通讯作者:刘超(1963—),男,湖北十堰人,博士,主任法医师,研究方向为法医学检案及研究。E-mail: liuchaogzf@163.com