穴位贴敷对合并过敏性鼻炎的哮喘缓解期血清miRNAs影响的研究*

王和生，周 姗，刘兰英△，吴文忠，张 聪，刘成勇，秦 珊，陈 栋

(1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029;2.连云港市中医院，江苏 连云港 222000)



临床研究

穴位贴敷对合并过敏性鼻炎的哮喘缓解期血清miRNAs影响的研究*

王和生1，周 姗2，刘兰英1△，吴文忠1，张 聪1，刘成勇1，秦 珊1，陈 栋1

(1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029;2.连云港市中医院，江苏 连云港 222000)

目的：根据前期研究筛选出的与合并过敏性鼻炎哮喘密切相关的8种miRNAs，观察穴位贴敷治疗对其含量影响。方法：选取本院2015年夏季穴位贴敷哮喘患者，按有无过敏性鼻炎，分为合并过敏性鼻炎组17例，单纯哮喘组17例，均使用咳喘停药贴穴位贴敷治疗;15例健康人作为健康组对照。采用RT-PCR法观察3组治疗前后8种血清miRNAs水平变化情况。结果：治疗前，合并过敏性鼻炎组及单纯哮喘组的血清miR-200a-3p水平均显著低于健康组，miR-95以及miR-34a-5p水平均显著高于健康组。与治疗前比较，单纯哮喘组与合并过敏性鼻炎组治疗后的血清miR-200a-3p水平有升高趋势，但无显著性差异；血清miR-95、miR-34a-5p水平有下降趋势，亦无显著性差异。其余5种miRNAs治疗前后均无显著性差异。结论：miR-200a-3p、miR-95以及miR-34a-5p与哮喘的发生、发展具有一定的相关性，穴位贴敷治疗对其具有一定的影响。

穴位贴敷；miRNAs；哮喘；咳喘停药贴；过敏性鼻炎

支气管哮喘(简称哮喘)，发病率近年来呈上升趋势，且该病具有病程迁延、反复发作等特点，现已成为全球性的健康问题[1]。哮喘与过敏性鼻炎是呼吸系统常见病，常相兼为病，同属呼吸道变态反应性炎症性疾病[2]。合并过敏性鼻炎的哮喘治疗更趋复杂性。microRNA(miRNA)是一种微小RNA，大多数人类疾病，如各种类型感染、慢性炎症等都有miRNA表达和功能异常[3]。有研究认为[4]，多种miRNAs可能与哮喘等呼吸系统疾病具有相关性，其可通过影响IL-4、IL-5等促炎细胞因子影响气道的炎症反应。笔者的前期小样本研究中，对单纯哮喘、合并过敏性鼻炎哮喘患者以及健康人的血清，进行了miRNAs芯片的初步筛选，发现与健康人比较，两组哮喘患者有8种miRNAs表达明显，主要有miR-543、miR-200a-3p、miR-605、miR-190a、miR-485-3p、miR-95、miR-421和miR-34a-5p。本研究拟扩大样本量，采用RT-PCR法探讨穴位贴敷治疗对这8种miRNAs的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年6月至8月间，本院针灸康复科门诊夏天咳喘停药贴穴位贴敷治疗的哮喘患者，按有无过敏性鼻炎，分为合并过敏性鼻炎组、单纯哮喘组以及健康组，根据排除标准，最终选取合并过敏性鼻炎组17例，其中男性9例，女性8例，平均年龄(53.48±9.57)岁，哮喘平均病程(13.95±11.69)年；单纯哮喘组17例，其中男性10例，女性7例，平均年龄(50.19±10.69)岁，哮喘平均病程(14.25±10.14)年；健康组15例，其中男性7例，女性8例，平均年龄(42.12±9.13)岁。3组资料比较，性别、年龄、病程均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 诊断标准

哮喘的诊断参照中华医学会呼吸病学会哮喘组制定的《哮喘患者防治指南(2008)》[5]；过敏性鼻炎的诊断参照WHO变应性鼻炎诊断标准[6]。

1.3 纳入标准

①符合上述诊断标准；②年龄≥14岁，≤75岁的哮喘缓解期患者，有或无过敏性鼻炎病史；③自愿知情同意参加本试验者。

1.4 排除标准

①合并有严重心、肝、肾疾患和支气管扩张、肺结核、血糖控制不佳的糖尿病患者等疾病；②妊娠或哺乳期妇女；③治疗期间哮喘急性发作患者，不能配合治疗者；④贴敷后皮肤局部出现严重损伤、破溃难以愈合者。

1.5 治疗方法

合并过敏性鼻炎组与单纯哮喘组两组治疗方法相同。咳喘停药贴：由本院制剂部制备。药物组成：延胡索、白芥子、细辛、生甘遂、麻黄、牙皂、肉桂、丁香、葶苈子，按2∶2∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1比例打粉过筛，后加生姜汁及液态凡士林混合，做成直径1 cm、质量约为3 g的丸状药，置于5 cm×5 cm胶布中心。取穴：双侧定喘、肺俞、膈俞、脾俞、肾俞。贴敷时间：从夏至开始至末伏结束，每隔5天贴1次，共贴10次，每次留药6 h左右，要求尽量在初伏第1天、中伏第1天和末伏第1天此3天进行穴位贴敷治疗。健康组不予贴敷治疗。

1.6 观察指标

RT-PCR法检测血清miRNAs水平。血液采集：3组分别于治疗前及最后1次治疗后采集静脉血液5 ml，以3 000 r/min转速离心5 min，取上清血清-70 ℃条件下储存；提取：35000 r/min转速再次离心10 min，取上清液，磁珠法循环提取核酸；逆转录；荧光定量检测，记录并计算CT值结果。miRNAs检测试剂盒由上海灏勤生物科技有限公司提供。

1.7 统计处理

2 结果

2.1 治疗前后血清miR-200a-3p水平变化情况

①治疗前，合并过敏性鼻炎组与单纯哮喘组血清miR-200a-3p水平均显著低于健康组(P<0.05)；两哮喘组比较，无显著性差异(P>0.05)；②与治疗前比较，合并过敏性鼻炎组及单纯哮喘组治疗后血清miR-200a-3p水平均有升高趋势，但无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1 治疗前后血清miR-200a-3pCT值比较

注：与健康组比较，P<0.05

2.2 治疗前后血清miR-95水平变化

①治疗前，合并过敏性鼻炎组与单纯哮喘组血清miR-95水平均显著高于健康组(P<0.05)；两哮喘组比较，无显著性差异(P>0.05)；②与治疗前比较，合并过敏性鼻炎组及单纯哮喘组治疗后血清miR-95水平均有下降趋势，但无显著性差异(P>0.05)。见表2。

2.3 治疗前后血清miR-34a-5p水平变化

①治疗前，合并过敏性鼻炎组与单纯哮喘组血清miR-34a-5p水平均显著高于健康组(P<0.05)；两哮喘组比较，无显著性差异(P>0.05)；②与治疗前比较，合并过敏性鼻炎组及单纯哮喘组治疗后血清miR-34a-5p水平均有下降趋势，但无显著性差异(P>0.05)。见表3。

表2 治疗前后血清miR-95CT值比较

注：与健康组比较，P<0.05

表3 治疗前后血清miR-34a-5pCT值比较

注：与健康组比较，P<0.05

2.4 治疗前后血清miR-543、miR-605、miR-190a、miR-485-3p、miR-421水平变化情况

①与健康组比较，治疗前单纯哮喘组与合并过敏性鼻炎组的血清miR-543、miR-605、miR-190a、miR-485-3p、miR-421水平均无显著性差异(P>0.05)；两哮喘组比较，无显著性差异(P>0.05)；②与治疗前比较，合并过敏性鼻炎组及单纯哮喘组治疗后血清miR-543、miR-605、miR-190a、miR-485-3p、miR-421水平均无显著性差异(P>0.05)。见表4。

3 讨论

“异病同治”理论早期可见于《内经》，汉·张仲景将其从辨证治疗方法发展到方药运用。穴位贴敷治疗合并过敏性鼻炎哮喘，充分体现了“异病同治”的思想。首先，过敏性鼻炎与哮喘虽属两种不同疾病，但中医认为，“肺开窍于鼻”，肺、气道、喉、鼻统称为“肺系”。《外台秘要》记载:“风乘肺，气不还鼻，则壅津寒液。”更表明鼻病与肺病的密切相关性。现代医学的“一个气道、一种炎症”“变应性鼻炎(即过敏性鼻炎)—哮喘综合征”等相关概念也形象体现了两者的密切相关性[7]。其次，从穴位及药物运用上，这两种疾病的选穴及用药相同。目前，三伏天穴位贴敷是临床上常见的防治过敏性鼻炎及哮喘的有效方法之一，其所选穴位及药物组成多见于《张氏医通》[8]。本研究所选穴位，如定喘、肺俞、膈俞、脾俞、肾俞穴等，多属膀胱经背俞穴，对肺、脾、肾等功能起补益、调节等作用。而贴敷所选药物白芥子、延胡索、甘遂、细辛等，具有温肺化痰作用。并且生甘遂、白芥子等，对皮肤具有一定的刺激作用，可加速药物的透皮吸收及药物对穴位的刺激作用。

表4 治疗前后血清miR-543、miR-605、miR-190a、miR-485-3p、miR-421CT值比较

miRNAs是近些年研究的热点，它的主要作用过程是miRNA结合到相应mRNA的3’未翻译区来抑制蛋白翻译和介导mRNA的降解，从而实现对靶基因mRNA翻译的调节[9]。研究认为[10]，miRNAs在哮喘的发病中也具有一定的调控作用。而与呼吸系统相关的miRNAs种类较多，许多仍需进一步验证。笔者前期研究中，分别随机选取单纯哮喘、合并过敏性鼻炎哮喘及健康人各3例，通过miRNAs芯片分析，发现与健康人比较，有8种miRNAs表达明显，可能参与哮喘的病程，主要为miR-543、miR-200a-3p、miR-605、miR-190a、miR-485-3p、miR-95、miR-421、miR-34a-5p。其中，与健康人比较，miR-605、miR-190a、miR-543、miR-485-3p表达下调至少2倍以上，而miR-200a-3p、miR-95、miR-34a-5p、miR-421表达上调至少2倍以上。这与目前报道[4]的与哮喘相关的常见miRNAs：miR-21、miR-155、miR-146、miR-145、let-7等不完全一致。

本研究中，治疗前，与健康组比较，单纯哮喘组与合并过敏性鼻炎组的血清miR-200a-3p水平均显著降低(P<0.05)，而miR-95以及miR-34a-5p水平均显著升高(P<0.05)。表明血清miR-200a-3p、miR-95以及miR-34a-5p与哮喘相关，且哮喘时，血清miR-200a-3p水平下调，miR-95以及miR-34a-5p水平上调。而与治疗前比较，治疗后的两组哮喘的血清miR-200a-3p水平虽无显著性差异，但有升高趋势，而血清miR-95、miR-34a-5p水平亦无显著性差异，但有下降趋势。这表明穴位贴敷对血清miR-200a-3p、miR-95以及miR-34a-5p具有一定的影响，它们可能参与了穴位贴敷治疗哮喘的作用机制。因关于穴位贴敷对miRNAs影响的报道极少，这3种miRNAs为笔者首次报道。

本研究中，与健康人比较，哮喘患者的血清miR-200a-3p水平下调，这与前期研究结果不相一致，未来可在进一步研究中扩大样本量进行验证。另一方面，穴位贴敷后，患者的血清miRNAs未见明显改变，分析原因，可能与观察时间短或样本量不足有关，未来研究会延长观察时间以及增加样本量。

[1]ToT,StanojevicS,MooresG,etal.Globalasthmaprevalenceinadults:findingsfromthecross-sectionalworldhealthsurvey[J].BMCPublicHealth,2012,12(1):204

[2]BousquetJ,SchünemannHJ,SamolinskiB,etal.AllergicRhinitisanditsImpactonAsthma(ARIA):achievementsin10yearsandfutureneeds[J].JAllergyClinImmunol,2012,130(5):1049-1062

[3]BrittainEL,HemnesAR.Onegeneration’s“junk”isanother’streasure:theemergingroleofmicroRNAsastherapeutictargets[J].JHeartandLungTransplant,2014,33(3):233-234

[4] 刘兰英，周姗，王和生.微RNA在支气管哮喘中与Th2相关促炎因子的研究进展[J].医学综述，2015,21(23)：4252-4255

[5] 中华医学会呼吸病学分会支气管哮喘病学组.支气管哮喘诊治指南(2008年修订版)[J].中华结核和呼吸杂志，2008，31(3)：177-185

[6] 中华医学会耳鼻咽喉科学分会，中华耳鼻咽喉科杂志编辑委员会.变应性鼻炎诊断标准及疗效评定标准(1997年修订，海口)[J].中华耳鼻咽喉科杂志，1998，46(33):134-135

[7] 赵欲转，李文娟，张莉萍.变应性鼻炎伴发哮喘的治疗[J].中国药物与临床，2010,10(1)：71-72

[8] 清·张璐.张氏医通[M].北京:中国中医药出版社，1995

[9]BarrelDP．MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，andfunction[J].Cell，2004，116(2)：281-289

[10] 徐晶，李满祥.MicroRNA与支气管哮喘[J].中华哮喘杂志(电子版)，2012,6(3)：43-47

Effect of Acupoint Sticking Therapy on Serum miRNAs of Asthma Patients with Allergic Rhinitis

WANG He-sheng1,ZHOU Shan2,LIU Lan-ying1△,WU Wen-zhong1,ZHANG Cong1,LIU Cheng-yong1,QIN Shan1,CHEN Dong1

(1.TheAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China;2.LianyungangChineseMedicineHospital,Lianyungang222000,China)

Objective：According to preliminary studies select eight miRNAs of asthma patients with allergic rhinitis,and to observe the effect of acupoint sticking therapy on them.Methods：Kechuanting paste acupoint sticking therapy was used for 17 asthma patients with allergic rhinitis and 17 asthma patients from our hospital in the summer of 2015,with 15 healthy persons as the control group. Use RT-PCR to detect blood miRNAs level before and after treatment.Results：Before treatment, serum miR-200a-3p levels of the combined allergic rhinitis group and simple asthma group was significantly lower than that of the healthy group,and miR-95 and miR-34a-5p were significantly higher than those of the healthy group. Compared with that before treatment, serum miR-200a-3p of the simple asthma group and combined allergic rhinitis group after treatment tended to increase, but there was no significant difference; serum miR-95 and miR-34a-5p levels had a downward trend, but there was no significant difference. MiRNAs of other five kinds before and after treatment had no significant difference.Conclusion：miR-200a-3p, miR-95 and miR-34a-5p have a certain relevance to asthma, and acupoint sticking therapy has a certain influence on them.

Acupoint pasting;miRNAs;Asthma;Kechuanting paste;Allergic rhinitis

国家自然科学基金项目，编号：81674065；国家自然科学基金青年基金项目，编号：81102632；江苏省人力资源与社会保障厅项目,编号：2014-WSN-015；“十二五”国家科技支撑项目,编号：2015BAI04B11。

王和生(1965-)，男，主任中医师，主要从事针灸推拿临床工作。

△通讯作者：刘兰英(1974-)，女，主任中医师，主要从事针灸推拿临床工作。

R246.81

A

1005-0779(2016)12-0001-03

2016-07-15