CO2与Er:YAG激光乳突切开及周围骨组织损伤研究

王晓燕郑燕青郑昊叶青

1福建医科大学省立临床医学院耳鼻咽喉科（福州350001）

2泉州市妇幼保健院.儿童医院（泉州362000）

·基础研究·

CO2与Er:YAG激光乳突切开及周围骨组织损伤研究

王晓燕1郑燕青2郑昊1叶青1

1福建医科大学省立临床医学院耳鼻咽喉科（福州350001）

2泉州市妇幼保健院.儿童医院（泉州362000）

目的以CO2激光与Er:YAG激光为辐射源，活体新西兰兔中耳骨作为靶组织，行激光消融乳突切开术，研究激光骨消融后对周围骨组织的影响，并与电钻磨骨术比较，初步评估激光乳突切开的可行性及其安全性，进一步拓展激光在耳科手术中的应用。方法24只新西兰兔随机分三组，分别采用电钻、CO2激光、Er:YAG激光为手术工具，研磨或消融中耳乳突骨，术后取磨骨或骨消融部位周边骨组织，扫描电镜观察消融骨组织表面形态特征，制作石蜡切片HE染色观察对比骨组织细胞变化情况，测量骨组织损伤深度，比较用此三种工具手术后对周围骨组织的影响。结果扫描电镜观察消融骨组织表面可见胶原成网状熔合及部分微裂缝改变；石蜡切片HE染色：磨骨或消融部位周边骨组织均见不同程度损伤改变，其中电钻组损伤最轻；中耳骨消融后的周边骨组织损伤深度存在组间差别（P＜0.01），电钻组损伤深度最小（P＜0.01）,两激光组之间无显著差别（P＞0.05）。消融骨组织周边不同部位损伤深度之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。结论激光骨消融乳突切开术具有可行性，激光消融骨组织后对周围骨组织的损伤程度大于电钻组，需要进一步研究评估并改进激光操作方式来提高手术视野清晰度、精准度以及安全性等。

中耳；激光；骨消融；损伤；乳突切开

Foundation：National Natural Science Foundation of China（61475036）；Project of Natural Science Foundation of Fujian Province（2011J01135）；Clinical Specialty Construction Project of Fujian Province.

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

随着科学技术进步，医疗水平的提高，不断有新手术器具应用于耳外科手术中。近年，激光技术的发展为耳科手术提供了又一有效工具，在耳科手术中激光骨消融主要用于激光镫骨切除术或镫骨足板造孔术[1-3]，激光耳蜗开窗亦有研究[4]，它不仅提供了凝固炭化、切割、气化等多种不同的手术方式，而且可以减少失血量，更为精确地切除不想保留的组织，具有较短的手术时间，术后并发症像耳鸣、眩晕、听力丧失、眼震颤等大大减少，术后疼痛亦减轻，充分体现了其优点所在。

在耳科手术中以乳突切开为最常见术式，目前常用手术工具为电钻，但电钻存在高噪音、钻头易损耗、操作不当致周围组织严重损伤等缺点，那激光是否可以作为乳突切开手术之一？在此选用了国内外骨消融中常用的两种激光——装有扫描技术的脉冲CO2激光与脉冲Er:YAG激光为辐射源，活体新西兰兔中耳骨为靶组织，活体兔上初步模拟乳突切开术，而后研究激光骨消融后周围骨组织损伤情况，并与传统电钻磨骨术进行比较，研究激光乳突骨消融切开术的可行性并初步评判其安全性，以期进一步拓展激光在耳科手术中的应用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要仪器

选取健康雄性成年新西兰兔24只，质量为2.0 kg-2.5 kg，实验动物均由福建省医学科学研究所实验动物中心提供。主要使用设备：以色列Sharplan 30C CO2激光外科系统、Sharplan Acuspot微控制器、Sharplan SurgiTouchTM 773 flashscanner扫描系统，美国Sciton公司Contour Profile 2940 Er:YAG激光治疗仪，德国Leica M520外科手术显微镜，瑞士Nou⁃vag MD20微动力系统（手术电钻、电锯），日本JSM-6380LV扫描电镜。

1.2 电钻及激光中耳乳突切开模型的建立

分别测得CO2激光器及Er:YAG激光器激光束射出后经不同装置后光斑尺寸随工作距离的变化关系，并结合操作方便性，确定光斑尺寸，找出激光对应的工作距离（表1）。根据激光器说明书推荐剂量及前期离体人乳突骨激光消融操作情况[5]，确定激光器参数（表2）。

将符合上述条件24只随机分成A、B、C三组，每组各8只，均以右耳为实验耳。A组（电钻组），B组（CO2激光组），C组（Er:YAG激光组），分别用以上三种工具手术。动物麻醉、固定、体位摆放、解剖至暴露乳突[6]。然后分别通过三种方式打开鼓泡暴露中耳腔：电钻组：使用电钻打开鼓泡暴露中耳腔，磨开乳突大小应约为10mm X 5mm孔，深部暴露中耳腔孔的大小约为5mm X 3mm（图1）。CO2激光组：将CO2激光器通过Acuspot微控制器耦合到手术显微镜（Leica M520）上，激光器连接flashscanner扫描装置（扫描系数设为：0.05），按照Acuspot微控制器说明书将耦合器散焦设为“3”，调整工作距离光斑大小（表1）。然后开启激光器，指示灯定位于暴露的乳突骨中央，设定激光器参数（表2），手控Acuspot微控制器操纵杆显微镜下操作，消融乳突骨至暴露中耳腔，消融骨的大小同电钻组相近。Er:YAG激光组：连接2mm手柄，开启激光器，指示灯定位于暴露的乳突骨中央，设定激光器参数（表2），手持手柄显微镜下非接触操作，工作距离约40-60mm（表1），激光消融乳突骨至暴露中耳腔，消融骨的大小同前两组相近。

表1 光斑大小、工作距离确定Table 1 Light spot size and working distance

表2 激光器参数设置及激光剂量的确定Table 2 Laser parameter setting and laser dose determination

术后6小时活体取下消融或研磨部位周围骨组织（图1），置于10%EDTA液中脱钙处理，常规制作石蜡切片，HE染色；同时留取激光消融部位骨组织样本放入2.5%戊二醛溶液中，采用1%锇酸溶液固定，丙酮脱水，冷冻干燥仪干燥制备标本、离子溅射镀膜，扫描电镜观察激光消融骨组织表面超微结构的变化。

图1 中耳乳突切开暴露中耳腔，箭头示用于制作组织切片所取骨组织部位Fig.1 Fenestration of mastoid bone; Arrow shows sampling sites

1.3 观察及测量指标

1.3.1 扫描电镜观察激光消融骨组织表面超微结构的变化，并拍照。

1.3.2 光学显微镜观察骨组织HE染色切片，连接显微照相机照相，研究比较电钻、激光对周边骨组织损伤所致细胞形态等改变。光学显微镜下确定骨组织损伤边界，连接显微照相机，用Olympus DP2-BSW分析软件测量消融骨周边骨组织损伤深度。测量方法：对组织切片中较不规则的骨组织断面取6处位置进行测量、记录（图2）。

图2 A骨组织切片测量实物图Fig.2 A Measuring physical map in bone tissue section

图2 a骨组织切片测量示意图Fig.2 a Measuring diagram in bone tissue section

1.4 数据处理

2 结果

2.1 扫描电镜观察

可见两激光消融骨组织表面胶原成网状熔合，可有一些散在骨屑，部分微裂缝改变（图3）。

图3 A:CO2激光消融骨组织表面扫描电镜像，SEM×200；Fig.3 A Surface scanning electric image of bone tissue after CO2laser ablationSEM×200；

图3 B Er:YAG激光消融骨组织表面扫描电镜像,SEM×200Fig.3 A Surface scanning electric image of bone tissue after Er: YAGlaser ablationSEM×200

2.2 周边骨组织形态结构的改变

电钻组：仅磨骨边缘极小损伤，骨细胞形态基本正常（图4 A,a）。CO2与Er:YAG激光组：两种激光消融周边骨组织可见细胞不同程度的损伤，越接近消融部位细胞损伤越严重，HE染色可见一较明显因骨组织损伤导致的“蓝化带”。消融边缘可见细胞结构消失，细胞变形、核消失、空泡变性等改变，再远处可见核边移，远离消融部位可见较正常的细胞结构。在消融过程中遇含骨髓骨质时还可导致骨髓发生“气穴现象”，脂肪细胞发生融合改变。（图4B,b为CO2消融周边骨组织形态结构改变；图4C,c；Er:YAG激光消融周边骨组织形态结构改变；“箭头”示损伤“蓝化带”）。

图4 中耳乳突骨部位开窗处周边骨组织形态结构改变(组织切片HE染色)Fig.4 Bone tissue morphologic characteristics after fenestration（tissue slicing and HE staining）

2.3 周边骨组织损伤深度

三组不同手术工具致开窗处周边骨组织损伤深度（整体均数之间的比较）存在组间差别（P＜0.01），电钻组损伤深度最小（P＜0.01）,两激光组之间无显著差别（P＞0.05）。不同部位（图1）损伤深度之间的差异无统计学意义（P＞0.05）（表3，图5）。

图5 开窗处周边不同部位（图1）骨组织损伤深度（±sd表示）Fig.5 The depth of bone tissue damages in different site after fenestration（±sd）

3 讨论

高能量密度的激光主要使组织发生气化、凝固、碳化等改变，能量密度稍低时主要产生凝固、碳化作用，当达到足够高能量密度时则可使组织发生气化、熔融、喷射和高温分解等现象，所有这些都将导致生物组织的去除和丢失[5]。激光产生这些作用的同时也可因激光热效应、压力效应等对周围组织产生损伤。对组织结构的热负荷，超过56℃会引起蛋白质凝固，这种热负荷的大小与应用持续时间、能量转移的量及能量穿透深度有关。而极低能量密度的激光对周围组织则不会造成损伤，临床上应用低剂量激光疗法（low-level laser therapy LLLT）促进创伤愈合[7]、治疗疼痛[8]，以及现在较热门的研究——光动力学疗法（photodynamic therapy PDT）[9]等。除能量密度外，对组织作用的激光因其他参数（波长、脉冲持续时间及输出方式等）、操作方式、以及组织成分等不同组织效应也不一样。本次实验选用的CO2激光（波长10.6μm）和Er:YAG激光（波长2.94μm），在我们选用的参数和光剂量情况下都可以对中耳骨进行有效消融，可在较短时间内进行乳突切开。通过扫描电镜观察激光消融后骨组织表面，发现两激光消融骨组织表面胶原成网状熔合，可有一些散在骨屑，部分微裂缝改变，这些表明激光消融后周围骨组织可能存在较明显的损伤。经过脱钙后，行组织切片HE染色结果显示：两种激光可引起周边骨组织明显热损伤，损伤程度远比电钻组重，在含骨髓多的组织中形成“气穴”改变，与Ivanenko等[10]应用调Q CO2激光对猪肋骨消融在松质骨中改变类似。尽管电钻对周边骨组织也有极小损伤（这主要与电钻机械损伤有关，可能与磨骨过程使局部温度稍增高也有一定关系），但其骨细胞形态正常，因此这种损伤意义不大几乎可以忽略，尤其在配合冲水的情况下。

在本研究中，激光开窗处周边骨组织损伤深度明显大于电钻组，但两激光间损伤深度并无显著差别，开窗周围不同部位（图1）损伤深度亦无明显差异，尽管激光类型、参数设置及开窗周边部位不同，但激光消融后骨组织损伤情况却类似。因此可以推测激光在有效骨消融情况下其周围骨组织累积损伤可能存在一限度——即激光造成周边骨的累积损伤达到一定限度时损伤急速衰减。设想目前临床上可以应用激光快速进行乳突骨部分切除后，在接近重要结构时更换为传统电钻磨骨，两工具联合进行乳突切开或轮廓化将是一可行的手术方式，这需要进一步的研究证实。

表3 开窗处周边不同部位骨组织损伤深度（n=8）（um）Table 3 The depth of bone tissue damages in different site after fenestration（n=8）（um）

4 结论

此次研究中，激光大面中耳骨消融具有可行性，可为临床上乳突骨切开术提供另一有效工具，但激光消融后周围骨组织的损伤深度及程度较电钻明显，其精确度有待提高，因此临床实际应用中在接近脑组织及重要血管及结构时，激光的使用应保持一安全界限，此安全范围需进一步确定，此外激光大面积骨消融操作的方式需进一步优化，如果选择反馈系统由计算机控制，并在消融过程中增加相应降温措施，如激光消融配上冲水装置[11]，则可能得到高的消融精确度。

1吴雅琴，殷善开，张胜兰，等.CO2激光辅助Fisch人工镫骨技术治疗耳硬化症疗效观察[J].听力学及言语疾病杂志，2006，14(5)：327-329. Yaqin Wu，Shankai Yin，Shenglan Zhang，et al.The Effect of CO2La⁃ser Assisted Stapedotomy with Artificial Stapes Prostheses on the Treatment of Otosclerosi[J].Journal of Audiology and Speech Pathol⁃ogy，2006，14(5)：327-329.

2 Szyfter W，Mielcarek-Kuchta D，Młodkowska A，et al.Stapedoto⁃mie with the use of CO2 laser--"one shot"technique[J].Otolaryn⁃gol Pol，2013，67(2)：87-94.

3 Albers AE，Schönfeld U，Kandilakis K，et al.CO2laser revision sta⁃pedotomy[J].Laryngoscope，2013，123(6)：1519-1526.

4 田天捷，叶青.激光耳显微外科动物模型的建立[J].中华耳科学杂志，2014，12（4）：680-680. Tianjie Tian，Qing Ye.Establishment of an Animal Model of Laser Otomicrosurgery[J].Journal of Otology，2014，12（4）：680-680.

5 郑燕青，叶青，陈新，等.脉冲CO2激光消融离体人乳突骨组织的特性[J].中国激光医学杂志，2009，18(3)：137-142. Yanqing Zheng，Qing Ye，Xin Chen，et al.Characteristic Research of Pulsed CO2 Laser Ablation on the in vitro Human Mastoid Bone Tis⁃sue[J].Chinese Journal of Laser Medicine and Surgery，2009，18(3)：137-142.

6 王晓燕，叶青，沈帆，等.兔中耳进路及中耳解剖结构的研究[J].山东大学耳鼻喉眼学报，2011，25（6）：37-40. Xiaoyan Wang，Qing Ye，Fan Shen，et al.Rabbit’s Middle Ear Ap⁃proach and Its Anatomic Structure[J].Journal of Otolaryngology and Ophthalmology of Shandong University，2011，25（6）：37-40.

7 Wu Q，Xuan W，Ando T，et al.Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice:Effect of Different Wavelengths[J].Lasers Surg Med，2012，44(3)：218-226.

8 Nakamura T,Ebihara S,Ohkuni I,et al.Low Level Laser Thera⁃py for chronic knee joint pain patients[J].Laser Ther，2014，23(4)：273-277.

9 Rigual NR,Shafirstein G,Frustino J,et al.Adjuvant intraopera⁃tive photodynamic therapy in head and neck cancer[J].JAMA Oto⁃laryngol Head Neck Surg，2013，139(7)：706-711.

10 Ivanenko MM，Fahimi-Weber S，Mitra T，et al.Bone tissue ablation with sub-microS pulses of a Q-switch CO(2)laser:histological ex⁃amination of thermal side effects[J].Lasers Med Sci，2002，17（4）：258–264.

11 Monzavi A,Shahabi S,Fekrazad R,etal.Implant Surface Tempera⁃ture Changes during Er:YAG Laser Irradiation with Different Cool⁃ing Systems[J].J Dent(Tehran)，2014，11(2):210-215.

CO2and Er:YAG laser mastoidotomy and its effects on surrounding middle ear bone tissue

WANG Xiaoyan1，ZHENG Yanqing2，ZHENG Hao1，YE Qing1
1 Department of Otolaryngology,Provincial Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350001,Fujian,China
2 Quanzhou Women and Children’s Hospital，Quanzhou 362000，Fujian,China

Objective To study the effects of CO2and Er:YAG laser bone ablation on surrounding bone tissue using a New Zealand Rabbit middle ear model to determine the feasibility and safety of laser mastoidotomy in ear surgery.Methods Twenty-four New Zealand Rabbits were randomly divided into three groups to undergo in-vivo mastoid bone ablation by the means of drilling,CO2laser or Er:YAG laser.Specimens of the ablation crater were examined by scanning electron microscopy.HE staining was used to assess thermal damage in the surrounding bone tissue.Results Collagen fusion and cracks were seen on scanning electron microscopy on the surface of the crater bone.Laser bone ablation caused more damage to surrounding bone tissue than bone cutting by drilling(P＜0.01),but there was no significant difference between the two laser groups(P＞0.05)or between different sampling locations(P＞0.05).Conclusions The two laser systems could ablate the bone rapidly in mastoidotomy operations,although they can cause more damage to surrounding bone tissue than traditional drilling.Further study is needed for optimization of laser techniques for large bone ablation.

Middle ear；Laser；Bone ablation；Damage；Mastoidotomy.

R764.9

A

1672-2922（2016）05-665-5

2016-03-25审核人：王国建）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.05.022

国家自然科学基金资助项目（61475036）；福建省自然科学基金项目（2011J01135）；福建省临床重点专科建设项目（闽卫医政【2015】593号）

王晓燕，硕士研究生，主治医师，研究方向:耳鼻咽喉临床及激光临床应用

叶青，Email:1158113213@qq.com