多指标综合评分法优选三拗汤提取工艺研究

张金花，刘陶世，程建明，毕肖林，钱海峰，陈冬冬

南京中医药大学药学院，江苏 南京 210046

多指标综合评分法优选三拗汤提取工艺研究

张金花，刘陶世，程建明，毕肖林，钱海峰，陈冬冬

南京中医药大学药学院，江苏 南京 210046

目的 采用高效液相色谱法同时测定三拗汤提取液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸4种有效成分的含量，优选三拗汤最佳提取工艺条件。方法 采用正交试验，以加水量、煎煮时间和煎煮次数为考察因素，以盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸转移率以及出膏率为考察指标，进行多指标综合评分。结果 三拗汤提取影响因素依次为煎煮次数＞煎煮时间＞加水量。最佳提取工艺条件为加10倍量水，煎煮3次，每次1 h。结论 本研究优选得到的提取工艺稳定可行。

三拗汤；正交试验；提取工艺

三拗汤源于张仲景还魂汤，后被《太平惠民和剂局方》收录，功效宣肺解表、止咳平喘[1]。为最大化提取方药有效成分加以利用[2]，本研究建立高效液相色谱法（HPLC）同时测定三拗汤提取液中4种有效成分方法，并结合正交试验筛选最佳提取工艺条件，为三拗汤新剂型研究奠定基础。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪（包括在线脱气机、自动进样器、柱温箱、2998紫外检测器），十万分之一电子分析天平（METTLER TOLEDO），Anke TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

麻黄、苦杏仁、甘草购自亳州市京皖中药饮片厂，经南京中医药大学刘圣金教授检测均符合2010年版《中华人民共和国药典》（一部）规定。对照品盐酸麻黄碱（批号171241-201007）、盐酸伪麻黄碱（批号171238-201207）、苦杏仁苷（批号820-200002）、甘草酸铵（批号110731-200511），中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸含量测定

2.1.1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷在208 nm波长下检测，甘草酸铵在250 nm波长下检测，柱温30 ℃，色谱图见图1。

表1 流动相梯度洗脱条件（%）

图1 三拗汤提取液中4种有效成分HPLC图

2.1.2 对照品溶液的制备 取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含43.7 μg盐酸麻黄碱、42.9 μg盐酸伪麻黄碱、202.1 μg苦杏仁苷和203 μg甘草酸铵的混合溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密量取提取液1 mL，加甲醇3 mL混匀，15 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察 取上述混合对照品溶液，精密取混合照品溶液2、4、8、10、20 μL，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：盐酸麻黄碱Y＝2.4×106X－9575，r＝0.999 5；盐酸伪麻黄碱Y＝2.5×106X－21 735，r＝0.999 5；苦杏仁苷Y＝4.7×106X＋45 295，r＝0.999 6；甘草酸铵Y＝7.6×105X＋10 028，r＝0.999 8。结果表明，盐酸麻黄碱在0.087 4～0.874 μg呈良好线性关系，盐酸伪麻黄碱在0.085 8～0.858 μg呈良好线性关系，苦杏仁苷在0.404 2～4.042 μg呈良好线性关系，甘草酸铵在0.406～4.06 μg呈良好线性关系。

2.1.5 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，连续进样6次，记录盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵峰面积，计算得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵的RSD分别为1.13%、1.81%、1.73%、1.13 %，表明精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，在0、2、4、6、8、10、12 h进样，记录峰面积，计算得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵的RSD分别为1.49%、1.58%、1.06%、1.35%，表明供试品溶液在12 h内稳定，可供检测。

2.1.7 重复性试验 平行制备5份三拗汤提取液，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵的RSD分别为0.92%、0.68%、0.60%、1.11%，表明本方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密移取已知含量的三拗汤提取液0.5 mL，平行9份，各精密加入样品含量80%、100%、120%的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵对照品适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵的平均加样回收率分别为101.15%、100.13%、99.98%、98.81%，RSD分别为1.12%、1.23%、1.56%、1.32%。

2.2 提取工艺考察

2.2.1 提取溶剂的考察 三拗汤中的有效成分主要为苷类和生物碱等，均易溶于有机溶剂，故选用水及95%、70%、50%、30%乙醇溶液作为提取溶剂进行考察，筛选出最合适的提取溶剂。采取加热回流提取方式，以盐酸麻黄碱、盐伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸转移率以及出膏率（精密移取滤液50 mL，放入干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴锅上蒸干，再移至105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，放置干燥器中冷却，迅速精密称定质量，计算，即得）为指标进行考察[3-4]。

称取5倍处方量饮片（麻黄9 g，苦杏仁9 g，甘草9 g），平行5份，第1次分别加10倍量水及95%、70%、50%、30%乙醇270 mL，回流提取1 h，过滤；第2次分别加8倍量水及95%、70%、50%、30%乙醇216 mL，回流提取1 h，过滤，合并2次滤液，测定4种有效成分含量及出膏率，结果见表2。

表2 不同提取溶剂4种有效成分转移率和出膏率比较（%）

从表2可以得出，95%乙醇提取后，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸转移率均低于其他溶剂，尤其是甘草酸的转移率只有7.15%；但是30%乙醇和50%乙醇提取后，苦杏仁苷的转移率超过了100%，可能是因为在含有乙醇的溶剂中L-苦杏仁苷转化成D-苦杏仁苷，而通常苦杏仁苷指D-苦杏仁苷，因此转移率超过100%；70%乙醇提取后，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸转移率比较高；水提取的转移率比70%乙醇提取的转移率稍低，无显著差异，考虑到工业生产成本以及操作中安全问题，本试验选择水为最佳提取溶剂。

2.2.2 正交试验设计与结果分析 对三拗汤的水提取工艺进行考察，采用L9（34）正交试验设计，对加水量、煎煮时间、煎煮次数3个因素进行考察。称取5倍处方量饮片（麻黄9 g，苦杏仁9 g，甘草9 g），按表4试验安排，以盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸转移率以及出膏率为考察指标，按下式计算综合评分（式中I为试验号），筛选最佳水提取工艺[5-6]。结果见表3～表5。

根据综合方差分析得出，煎煮次数对盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸转移率以及出膏率有显著影响，加水量与煎煮时间对盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸转移率以及出膏率影响不显著，可能是因为这4种有效成分均为易溶解成分，很容易从水中提取出来；各因素对盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸转移率以及出膏率影响因素大小为C＞B＞A，C有显著影响，A和B无显著影响。根据直观分析可以得出最佳工艺条件为A3B3C3，由于煎煮时间和加水量对转移率的影响不显著，为了缩短时间及提高效率，选择煎煮时间为1 h，加水量为10倍量，故最佳提取工艺条件为A2B1C3，即加水量为10倍量，煎煮时间为1 h，煎煮3次。

表3 正交试验因素与水平

表4 正交试验结果与直观分析（%）

表5 综合评价方差分析

2.2.3 优选提取工艺的验证 为进一步考察上述优选提取工艺的稳定性，称取5倍处方量饮片（麻黄9 g，苦杏仁9 g，甘草9 g），按最佳条件重复提取3次，按上述制备方法和检测方法分析优选工艺的稳定性，结果见表6。按照最佳工艺条件对三拗汤进行提取后，有效成分的转移率均较高，且稳定性好，说明该工艺条件合理可行。

表6 提取工艺验证结果（%）

3 讨论

本研究采用HPLC同时测定三拗汤中4种有效成分盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵，方便快捷。试验曾考察乙腈-磷酸缓冲盐溶液、乙腈-磷酸二氢钾溶液、甲醇-磷酸二氢钾溶液、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水等体系，均不能使4种有效成分得到较好分离；而使用乙腈-0.1%磷酸体系进行梯度洗脱时，4种有效成分得到良好分离，且分离度＞1.5，符合要求。在考察乙腈-0.1%磷酸体系时发现，两者比例微调对有效成分分离效果有显著影响；在190～400 nm波长下进行全波长扫描，发现盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱与苦杏仁苷在208 nm波长处有最大吸收，甘草酸铵在250 nm波长处有最大吸收。

本研究对三拗汤提取溶剂进行了考察，发现水提时有效成分的转移率比较高，可作为最佳提取溶剂。用正交试验设计筛选出的最佳提取工艺条件为：加水量为10倍，煎煮时间为1 h，煎煮3次。验证试验结果表明，该工艺稳定可行。

[1] 刘景源.太平惠民和剂局方[M].北京：人民卫生出版社,2007：60.

[2] 毕云生,潘函清,赵普军,等.HPLC测定麻杏石甘汤中麻黄碱的含量[J].中成药,2004,26(9)：附7.

[3] 张新勇,徐中南,张勇耀,等.三子养亲汤提取工艺研究[J].中成药, 2004,26(6)：500-501.

[4] 董明纲,郭春燕,张力,等.赤芍中芍药苷提取溶剂的选择[J].四川中医,2006,4(6)：35-37.

[5] 马建红,聂继红,邢建国.黄芩提取工艺的优化[J].新疆中医药,2006, 24(2)：8-9.

[6] 李莹,张慧敏,何瑶,等.四逆汤制备工艺参数优化[J].中成药,2013, 35(6)：1175-1179.

Study on Extracting Process of San Ao Decoction by Multi-indexes Grading Method

ZHANG Jin-hua, LIU Tao-shi, CHENG Jian-ming, BI Xiao-lin, QIAN Hai-feng, CHEN Dong-dong (College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

Objective To simultaneously determinate the contents of four active ingredients (Ephedrine Hydrochloride, Pseudoephedrine Hydrochloride, Amygdalin and Glycyrrhizinate) of San Ao Decoction by HPLC; To optimize the extracting process of San Ao Decoction. Methods The orthogonal test was employed. Volume of water, time of extraction and times of extraction were set as investigation factors; the transport rates of Ephedrine Hydrochloride, Pseudoephedrine Hydrochloride, Amygdalin and Glycyrrhizinate and the extraction rates were set as investigation indexes to conduct multi-indexes grading. Results The influence factors of the extraction of Sao Ao Decoction were the times of extraction > decoction time > the volume of water. The best extraction condition was: ten fold water; extract for three times; 1 h for each time. Conclusion The optimized extraction process is stable and feasible.

San Ao Decoction; orthogonal test; extracting process

R283.5

A

1005-5304(2016)04-0091-04

2015-06-17）

（

2015-12-03；编辑：陈静）

国家自然科学基金（81403114）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（2014年）

刘陶世，E-mail：tsliur4111@sina.com

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.024