Box-Behnken设计-效应面法优化莲心碱羟丙基-β-环糊精包合物制备及表征

周江，吴婷婷，李美云，雷小小，唐婷，桂卉

湖南省中药现代化研究重点实验室，湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208

Box-Behnken设计-效应面法优化莲心碱羟丙基-β-环糊精包合物制备及表征

周江，吴婷婷，李美云，雷小小，唐婷，桂卉

湖南省中药现代化研究重点实验室，湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208

目的 优选莲心碱羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）包合物的最佳制备工艺，考察莲心碱HP-β-CD包合物体外溶出性质。方法 采用饱和水溶液法制备包合物，以45 min体外累积溶出度为指标，采用三因素三水平Box-Behnken设计，考察HP-β-CD与莲心碱投料比、搅拌时间、包合温度对制备工艺的影响，对结果进行多元线性和二项式拟合，效应面法筛选出最佳包合工艺，进行预测分析和验证试验，并应用显微电镜扫描法、差示量热扫描法、红外光谱、X射线衍射法对包合物进行结构表征。结果 莲心碱HP-β-CD包合物的最佳制备工艺为：HP-β-CD用量为莲心碱投料量的4.5倍，搅拌时间为3.7 h，包合温度为52 ℃。表征鉴定结果显示莲心碱HP-β-CD包合物已形成。结论 本研究优选的最佳包合工艺稳定可行，能显著提高莲心碱的溶出度，增加其生物利用度。

莲心碱；羟丙基-β-环糊精；包合物；Box-Behnken设计-效应面法；累积溶出度

莲心碱（liensinine）是中药莲子心中含量较高的一种双苄基异喹啉类生物碱，具有降压、抗心律失常、抗氧化、对抗血栓形成等作用[1-3]，具有良好的开发应用前景。但莲心碱在水中溶解度差，口服溶出速率较慢，极大地限制其临床应用。通过增加其在体外的溶出速率有望提高莲心碱在体内的生物利用度。包合技术具有增加药物溶解度、降低药物刺激性、减少毒性、提高药物稳定性、提高生物利用度等优点[4-5]。本研究采用相溶解度法考察羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）对莲心碱的增溶作用，以体外45 min累积溶出度为指标，通过Box-Behnken试验设计优化莲心碱HP-β-CD包合物的制备工艺，运用显微电镜扫描法、差示量热扫描法、红外检测法、X射线衍射法对莲心碱HP-β-CD包合物进行物相鉴定。

1 仪器与试药

傅里叶红外扫描仪（FTIR-8000，日本岛津公司）；ZRS-8G型溶出仪（天津大学无线电厂）；756PC型紫外分光光度仪（上海奥普勒有限公司）；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华有限责任有限公司）；CP-114型电子分析天平（上海奥豪斯公司）；X衍射扫描仪（北京宏昌信科技有限公司：XRD系列）；差示量热扫描仪（美国TA公司，Q2000）；REM电子扫描仪（FEI公司，Quanta-200）。

莲心碱标准品（上海源叶生物有限公司，HPLC纯度≥98％，批号20121122）；莲心碱（自制，含量≥50％）；HP-β-CD（上海源叶生物科技有限公司）；甲醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的绘制

在200～700 nm进行全波长扫描，结果显示在282 nm处包合物中莲心碱及莲心碱标准品均有最大吸收。配制不同浓度莲心碱标准品，测量其吸光度值，得线性回归方程：Y＝0.139X＋0.018 3，r＝0.999 2。

2.2 精密度试验

精密量取标准品溶液（0.10 mg/mL）1 mL，用甲醇定容至10 mL，取6份标准品溶液各1 mL，按标准曲线方法操作，测量吸光度值分别为0.119、0.117、0.120、0.120、0.120、0.121，计算得RSD＝0.65％，结果表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验

精密量取莲心碱标准品（0.10 mg/mL）1 mL，定容至10 mL，每隔2 h取样，于282 nm处测定紫外吸光度值，分别在0、2、4、6、8、12 h测得吸光度值为1.328、1.340、1.344、1.335、1.343、1.332，平均值为1.337，RSD＝0.206％（n＝6）。结果表明莲心碱标准品溶液在12 h内较稳定。

2.4 相溶解度法

在HP-β-CD浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.125、0.2 mol/L的水溶液中（100 mL）添加莲心碱提取物0.5 g（含莲心碱4 mg），于25 ℃磁力搅拌，让其平衡4 h，溶解平衡后取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，测量其吸光度值，计算莲心碱的表观溶解度，以HP-β-CD溶液浓度为横坐标、莲心碱的表观溶解度为纵坐标，绘制平衡相溶解度曲线。结果表明，在0～0.2 mol/L范围内，随着HP-β-CD浓度的增加，莲心碱的表观溶解度呈良好的线性增加，其相溶解度方程为Y＝0.828 0X＋0.225 0，r2＝0.999 1。说明莲心碱与HP-β-CD以摩尔比1∶2的比例（质量比约1∶4）进行包合，且HP-β-CD具有提高莲心碱溶解度的作用[6]。

2.5 累积溶出度测定

按照2010年版《中华人民共和国药典》（二部）附录ⅩC溶出度测定方法（桨法）测定溶出度。取样品各1 g，以pH 6.8磷酸盐缓冲液为溶出介质，转速为100 r/min，分别在0、3、8、10、20、30、45 min时取样7 mL（取样后立即补充等量的溶出介质），过0.45 μm微孔滤膜，取滤液作为供试品，在282 nm处测定其吸光度值，按下式计算累积溶出百分率。

q（％）＝[Cq×V1＋(C1＋C2＋…＋Cq-1)×V2]/M/1000×100％

其中，q（％）为第q个取样点时的累积溶出百分率；Cq为第q个取样点时的药物浓度；V1为溶出介质的总体积，V1＝1000 mL；V2为每次取样的体积，V2＝7 mL；M为称取的样品含莲心碱的量。

精密称取莲心碱原料药3份，分别为1.01、0.99、1.01 g，按上述方法测得3份原料药样品45 min累积溶出度分别为22.70％、21.34％、22.59％，样品累积溶出度平均值为22.54％。

2.6 Box-Behnken设计-效应面分析法优选包合物制备工艺

2.6.1 试验设计与结果 通过预试验得知，采用饱和水溶液法制备莲心碱包合物对莲心碱的增溶效果较好，影响包合物包合的主要因素为药物与HP-β-CD比例、搅拌时间、包合温度，每个因素设计3个水平（低、中、高分别以-1、0、1进行编码），因素水平见表1。以包合物中莲心碱的累积溶出百分率（Y）为指标，筛选莲心碱包合的最佳工艺，按Box-Behnken试验设计的统计学要求，各组试验安排及结果见表2，模型方差分析见表3。

表1　Box-Behnken设计因素水平

2.6.2 模型拟合及显著性检验 采用Design-Expert 8.05软件对上述试验数据进行多元回归拟合，得到二次回归方程模型为：Y＝-401.896 50＋21.450 50A＋3.944 88B＋16.325 12C－0.461 25AB－0.232 25AC＋0.125 62BC－0.854 44A2－1.147 56B2－0.150 70C2，决定系数R2＝0.891 1。对该回归模型及其系数进行方差分析，结果显示该模型方程达到极显著水平（P＜0.01），且失拟项不显著（P＞0.05），表明该回归模型的拟合情况良好，回归方程的代表性较好，能准确预测实际情况。其校正决定系数（R2adj）为0.971 2，表明此模型能解释97.12％效应值变化，因此该模型拟合程度良好，试验误差小，仅有约4％不能由此模型进行解释。

表2　Box-Behnken设计方案与试验结果

表3　二次回归模型方差分析结果

2.6.3效应面的优化与分析根据回归分析结果，采用Design-Expert8.05软件做三维图（见图1）。从曲面图和等高线图可以直观看出，HP-β-CD用量和包合温度对包合物的溶出性能有极其显著的影响（P＜0.001），而搅拌时间对溶出性能的影响次之。当HP-β-CD用量、搅拌时间及包合温度逐渐增加时，包合物的溶解性能均为先增大后减小。当HP-β-CD用量约为4倍、搅拌时间约4 h、包合温度约50℃时，包合物的45 min累积溶出度接近最大值。根据本试验目的，要求包合物累积溶出度越大越好，通过Design-Expert8.05软件可找到最佳包合工艺参数，即HP-β-CD用量为莲心碱投料量的4.45倍，搅拌时间为3.68 h，包合温度为52.26℃。

图1　HP-β-CD用量、搅拌时间、包合温度对包合物溶解性能的影响

2.6.4模型的预测与验证考虑到实际操作方便，将最佳包合工艺修正为：HP-β-CD用量为莲心碱投料量的4.5倍，搅拌时间为3.7 h，包合温度为52℃。在此条件下，莲心碱包合物的45 min累积溶出度的理论值为79.77％。按修正后的最佳包合工艺进行验证试验，测得的莲心碱45 min累积溶出度为（78.58± 1.21）％。与理论预测值比较接近，说明此模型拟合度高，基于Box-Behnken设计所得的最佳包合工艺参数准确可靠。

Optimal Preparation and Characterization of Liensinine HP-β-CD Inclusion Compound by

Box-Behnken Design-Response Surface Methodology

ZHOU Jiang, WU Ting-ting, LI Mei-yun,

LEI Xiao-xiao, TANG Ting, GUI Hui (Hunan Provincial Modernization Key Laboratory of Chinese Medicine, College of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

Objective To optimize the preparation of liensinine HP-β-CD inclusion compound; To investigate its dissolution performance in vitro. Methods The inclusion compound of liensinine was prepared by using saturated water solution method; the cumulative dissolution (45 min) was used as an indicator and Box-Behnken design was adopted to evaluate the influence of feed ratio, mixing time and inclusion temperature on preparation process. Results were analyzed by multiple linear and binomial fitting; response surface methodology was used to screen the optimal inclusion process; predictive parsing and verification experiment were conducted; SEM, DSC, IR, and XRD were applied for the structural characterization of inclusion compound of liensinine. Results The optimal preparation process was: HP-β-CD was 4.5 times the amount of liensinine feeding amount; mixing time was 3.7 h; inclusion temperature was 52 ℃. HP-β-CD inclusion compound of liensinine formed. Conclusion Optimal inclusion process is stable and feasible, which can significantly improve the dissolution of liensinine and increase its bioavailability.

liensinine; HP-β-CD; inclusion compound; Box-Behnken design; cumulative dissolution

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.022

R283.5

A

1005-5304(2016)03-0080-05

湖南省高校创新平台开放基金（13K078）；湖南省科技计划项目（2013SK3100）

桂卉，E-mail：guihui1993@126.com