PCR检测技术在奶牛结核病鲜乳样本监测中的应用

岳 筠 ， 程振涛 ， 欧德渊 ， 徐春志 ， 袁翠霞 ， 张 华

(1.贵州省动物疫病预防控制中心 ， 贵州贵阳550008 ； 2.贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025 ； 3.贵阳市动物疫病预防控制中心 ， 贵州贵阳550081)



PCR检测技术在奶牛结核病鲜乳样本监测中的应用

岳 筠1， 程振涛2， 欧德渊2， 徐春志3， 袁翠霞3， 张 华1

(1.贵州省动物疫病预防控制中心 ， 贵州贵阳550008 ； 2.贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025 ； 3.贵阳市动物疫病预防控制中心 ， 贵州贵阳550081)

奶牛结核病是一种严重的人兽共患传染病，为建立可快速评估鲜乳污染状况、追溯传播途径的试验方法，本试验根据牛分枝杆菌基因组合成特异性引物，建立普通PCR方法和实时荧光定量PCR方法，并评价该方法的性能。结果可见，本试验所建立的普通PCR方法和实时荧光定量PCR方法能有效检测牛分枝杆菌目的基因，且均具有较好的敏感性、特异性，可对鲜乳样本进行检测，且实时荧光定量PCR方法比普通PCR方法更敏感。试验结果表明，所建PCR方法可用于鲜乳样本牛分枝杆菌的定性和定量检测，这为鲜乳牛分枝杆菌污染状况和食品安全评估提供重要技术。

鲜乳 ； 牛分枝杆菌 ； PCR ； 建立 ； 应用

奶牛结核病(Bovine tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的人兽共患慢性传染病，严重威胁人类身体健康及公共卫生安全。研究资料显示，患病奶牛是结核病的重要传染源，可随鼻汁、粪便和乳汁污染饲料、饮水、鲜乳等，使其呈现畜群间和人畜间传播。一些研究认为肺结核病人中约15%的结核病人是饮用了结核病牛的奶而发病[1]。奶牛结核病传统检测方法有细菌分离鉴定、免疫学检验等方法，随着分子生物学技术发展，PCR技术被广泛应用于疫病诊断、动物性食品卫生安全等领域[3-4]，其可用于鼻液、乳样、血液等样本的检测。我国《动物结核病诊断技术》国家标准(GB/T 18645-2002)规定，乳液可以作为检测样本用于牛结核病诊断，与其他诊断检测样本比较，鲜乳样品具有易采集、对动物无伤害等优点，提高了监测样本采集效率。为贵州省奶牛结核病流行状况与鲜奶结核杆菌污染状况评估储备技术，本试验基于牛分枝杆菌基因组合成特异性引物，构建普通PCR方法和实时荧光定量PCR方法，评估两种方法对鲜乳样本检测效果的优劣与可应用性，为牛结核病检疫与鲜奶食品安全评估提供关键技术。

1 材料与方法

1.1 参考菌株 牛分枝杆菌参考菌株(GIMI-267)，购自上海研生生化有限公司。大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、枯草杆菌等菌株均为贵州大学预防兽医学实验室提供；副结核分枝杆菌、禽结核杆菌由贵州大学动物疫病研究所提供。

1.2 主要试剂 改良罗氏培养基，购自上海研生生化有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、SYBR®Premix ExTaqTMⅠ(Perfect Real Time)试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司。 其他试剂为国产分析纯。1.3 引物合成 参考GenBank数据库牛分枝杆菌基因序列(CP009449.1)，基于插入序列IS6110基因合成1对牛分枝杆菌特异性引物(TB-P-F：5′-GGATCCTGCGAGCGTAGGCG-3′，TB-P-R：5′-CATCAGCCGCGTCCACGC-3′)，预期扩增片段大小为323 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 牛分枝杆菌核酸提取 配制改良罗氏培养基，取菌液以划线方式接种于培养基上，置于37 ℃恒温箱中培养5～7 d，待观察到培养基逐渐由浅蓝色变为深蓝色，将1 000 μL灭菌双蒸水加于固体培养基表面，洗脱菌落，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌核酸，-20 ℃保存备用。

1.5 PCR方法体系建立 构建普通PCR和实时荧光定量PCR反应体系与反应条件，普通PCR 50μL反应体系包括：2×TaqPCR MasterMix为25 μL，TB-P-F和TB-P-R(10 μm/L)分别为2 μL，DNA模板为2 μL，灭菌去离子水补足50 μL体系；反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30s，35个循环；72 ℃ 5 min。实时荧光定量PCR反应体系与反应条件，50 μL反应体系包括：SYBRGreen I 25 μL，引物、模板DNA同普通PCR方法，灭菌去离子水补足50 μL体系；反应条件：同普通PCR方法，40个循环。以上述反应体系和条件于PCR仪进行目的基因扩增。

1.6 PCR方法性能评价

1.6.1 敏感性的测定 将牛分枝杆菌DNA样本按10倍梯度稀释，分别进行普通PCR和FQ-PCR扩增，计算两种方法的最小DNA检测浓度。

1.6.2 特异性试验 提取奶牛场常见细菌大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、枯草杆菌、副结核分枝杆菌、禽结核杆菌的DNA进行PCR扩增，以牛分枝杆菌为阳性对照，检测两种方法的特异性。

1.7 临床应用性比较 对26份临床疑似阳性鲜乳样本应用普通PCR和FQ-PCR分别进行检测，比较两种方法的临床应用性。

2 结果

2.1 PCR方法建立 取两份牛分枝杆菌DNA样本，应用引物TB-P-F/TB-P-R分别进行普通PCR和荧光定量PCR扩增，结果见图1、2。

图1 PCR 扩增结果

M：DL-2 000 Marker；1～2：待检样本；3：阴性对照

图2 荧光定量PCR 扩增结果

M：DL-2 000 Marker；1～5：牛结核分枝杆菌、大肠杆菌、链球菌、枯草杆菌、葡萄球菌DNA待检样本；-：阴性对照

由图1、2可见，所构建的反应体系和反应条件能有效扩增牛分枝杆菌参考株DNA样本目的基因，与预期扩增片段大小相符，且荧光定量PCR方法Ct值均小于30，而阴性对照Ct值均大于30，因此，设定阳性样本判定标准为Ct值≤30。

2.2 两种PCR方法性能比较

2.2.1 敏感性检测结果 将已知DNA样本(OD260=0.042，DNA浓度为0.021 μg/μL)进行10倍倍比稀释，不同浓度样品分别进行普通PCR和FQ-PCR扩增，结果可见，所建立的牛分枝杆菌普通PCR方法可检测到103倍稀释度，即最小DNA检测浓度为8.4pg/μL；所建实时荧光定量PCR方法可检测到105倍稀释度，即最小检出浓度为8.4×10-2pg/μL。2.2.2 特异性检测结果 以大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、枯草杆菌、副结核分枝杆菌、禽结核杆菌为对比菌株，以牛分枝杆菌作为阳性对照进行PCR扩增见图3、4。普通PCR结果可见，除牛分枝杆菌DNA样本外，其他DNA样本均未扩增出任何条带；荧光定量PCR 结果可见，牛分枝杆菌DNA样本扩增曲线Ct值小于30，其他参考菌株DNA样本扩增曲线Ct值均大于30，因此所建立的普通PCR方法和实时荧光定量PCR方法均具有较好的特异性。

2.3 两种方法应用性比较结果 通过对26份临床疑似结核病奶牛鲜乳样本进行普通PCR和实时荧光定量PCR检测，结果见图5-7。由图5和图6可见，在26个所检测的样品中，除了3号、5号、8号、17号、20号、25号为阴性外，其他样本均有明显的目的基因条带；由图7可见，26份鲜乳样本实时荧光定量PCR检测有23份显阳性，3份阴性。

图3 普通PCR 特异性检测结果

图4 实时荧光定量PCR 特异性检测结果

图5 样品检测结果

M：DL-2 000 Marker；1～13：待检样品；-：阴性对照

图6 样品检测结果

M：DL-2 000 Marker；14～26：14至26号待检样品；-：阴性对照

图7 鲜乳样本实时荧光定量扩增曲线

3 讨论

牛结核病是一种慢性传染性人兽共患传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为必报传染病，我国将其列为二类动物疫病，也是国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)中优先防治的病种[4]。张高迪等[5]通过试验发现结核病人中10.6%为牛分支杆菌感染，而1979、1985、1990年3次全国结核病流行病学调查显示，由牛型分枝杆菌导致的结核病所占的比例分别为3.8%、4.2%、6.4%[4]。因此，牛群、鲜奶及其制品牛分枝杆菌感染(或污染)情况评估预警是防控人结核病的关键。目前，我国牛结核病的检疫主要采用变态反应试验检测阳性牛并扑杀，但这种方法无法区分其他分枝杆菌感染(如副结核分枝杆菌)，易出现假阳性反应，且无法区分患病牛和BCG免疫牛[5]。目前国际上推行γ-干扰素法提高了该病检测的特异性、敏感性[6]，但价格高，不易于推广。鉴于上述免疫学技术不具备评估环境污染状况、鲜乳污染状况的功能，且基于DNA聚合酶扩增技术的牛分枝杆菌检测方法得到了快速发展[7-8]，本文选择牛分枝杆菌保守基因区域合成特异性引物，构建了可检测牛分枝杆菌病原核酸的普通PCR方法和实时荧光定量PCR方法，结果显示，两种方法均具有良好的敏感性和特异性，可用鲜乳样本的检测。其中实时荧光定量PCR技术较普通PCR技术敏感100倍，对26份皮内变态反应阳性奶牛乳样检测亦显示实时荧光定量PCR技术(88.4%，23/26)检出率高于普通 PCR 技术(76.9%，20/26)，这与孟茹等[9]所建方法敏感性类似。此外，实时荧光定量PCR方法还可结合标准曲线实现对鲜乳样本、环境样本牛分枝杆菌污染程度进行定量评估，可用于对污染的追踪溯源。

[1] 徐广贤，赵德明.牛分枝杆菌与肺结核分枝杆菌基因组的比较[J].现代生物医学进展，2006，6(7)：67-69.

[2] 王云鹤，包红梅，孙佳善，等.H7N9 亚型禽流感病毒RT-PCR 检测方法建立[J].中国农业科学，2015，48(15)：3050-3055.

[3] 唐振柱，孙贵娟，黄彦，等.实时荧光PCR在食源性致病菌监测中的应用研究[J].中国食品卫生杂志，2010，22(4)：332-335.[4] 徐美英，刘坦业，钟能荣，等.牛分枝杆菌肺结核17例报告[J].中国人兽共患病杂志，1998，14(6)：76.

[5] Wedlock D N，keen D L.Effect of different adjuvants on the immune response of cattle vaccinated with Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins[J].Vet Immunol Immunopathol，2002，86(1-2)：79-81．

[6] 陈祥，徐正中，时振华，等.γ-干扰素试验和皮试变态反应对检测奶牛结核病的比较[J].中国人兽共患病学报，2011，27(2)：97-100.

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[8] 王春雨，王振国，刘金华，等.应用TaqMan荧光定量PCR检测牛分枝杆菌[J].中国预防兽医学报，2011，33(2)：133-136.

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2015-09-10

贵阳市科技计划项目[筑科合同(2012)207号]；贵州省农业攻关项目[黔科合NY字(2011)3061号]；贵州省农业攻关项目[黔科合NY字(2014)3042号]

岳筠(1981-)，女，兽医师，硕士，主要从事动物病原学研究，E-mail：yunyun810903@163.com

程振涛，E-mail：chengzhentao@sohu.com

S852.61

B

0529-6005(2016)10-0077-03