拟南芥SNC1基因突变对植株细胞分生和抗氧化性状的影响

莫旭东，邓东京，覃 磊，才桑吉，莫 祎，夏石头*

(1 植物激素与生长发育湖南省重点实验室，长沙 410128； 2 湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128；3 湖南农业大学国际学院，长沙 410128)



拟南芥SNC1基因突变对植株细胞分生和抗氧化性状的影响

莫旭东1，2，邓东京3，覃 磊1，2，才桑吉2，莫 祎2，夏石头1，2*

(1 植物激素与生长发育湖南省重点实验室，长沙 410128； 2 湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128；3 湖南农业大学国际学院，长沙 410128)

以拟南芥snc1突变体、其抑制子突变体mos4snc1和Col-0野生型植株为材料，研究了SNC1基因突变对植株细胞分生和抗氧化性状的影响。结果表明，snc1植株平均比Col-0植株矮65.05%，其第3、4片真叶平均长度比Col-0的短53%，叶片平均宽度比Col-0的窄51%，角果荚平均短9.48%，平均种子数量少20.69%。与Col-0野生型植株相比，snc1植株第1、2片真叶细胞数目平均减少53.14%，而第3、4叶细胞数目平均减少61.88%；snc1突变体的SOD、POD、CAT酶活性和植株中花青素积累量均极显著高于Col-0野生型植株的，而snc1的抑制子突变体mos4snc1则恢复了野生型表型，其SOD、POD酶活性和花青素含量与Col-0野生型植株的没有显著差异。这说明SNC1基因突变严重影响了拟南芥植株的细胞分生和抗氧化性能力，导致细胞数目大幅度减少，株型矮小。

拟南芥；SNC1；细胞分生；抗氧化性状

植物抗性(Resistance，R)基因编码蛋白能有效针对病原菌快速诱导防御反应，从而保证植株的正常生长发育[1]。植物和病原菌的相互识别会诱导产生活性氧，由于病原菌的无毒基因和植株抗性基因识别后的型号传递激活了各类防卫反应，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)迸发是过敏性反应的特征，因此，植物的抗病性一定程度上会影响到植物的抗氧化性。在没有病原菌攻击时，抗性蛋白水平须受严格控制，以防止抗性途径不必要激活而导致自身免疫的潜在伤害与生长缺陷[1]。在正常生长状态下，植物体内存在一个完备的清除ROS的防御机制，其体内ROS的产生和清除会维持在一个动态平衡之中[2]。然而当植物遇到胁迫时，这种动态平衡会被破坏，而随着植物受到胁迫时间的延长和受胁迫程度加重，体内ROS清除系统的功能会逐渐降低，ROS会逐渐累积而导致细胞膜脂过氧化并发生自由基链式反应，使细胞膜流动性下降，膜功能受到伤害[3]。ROS酶促清除系统主要是超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等，通过这些酶活性的高低可以在一定程度上反应出植物抗性的强弱。花青素也是一种自由基清除剂，它能和蛋白质结合防止其过氧化，在同等生长情况下花青素的含量也能一定程度上反应出植株的抗氧化性[4]。

拟南芥SNC1(suppressorofnpr1-1，constitutive1)是植物细胞内的一种TIR-NB-LRR (Toll/interleukin-1 receptor-Nucleotide Binding-Leucine Rich Repeat)类R蛋白编码基因，其序列中的一个碱基点突变导致SNC1蛋白氨基酸序列中的一个谷氨酸(Glu)变成了赖氨酸(Lys)，从而组成型激活了病程相关蛋白如PR1和PR2的持续高表达，导致snc1突变体植株株型矮小，叶片卷曲，属于获得功能型突变体[5]。进一步的研究发现，snc1的一个抑制子突变可部分抑制其抗病途径的组成型激活与SNC1介导的抗病表型，使mos4 (modifierofsnc1-1，4)植株恢复野生型表型[6，7]。为进一步深入探讨SNC1基因持续激活对植株生长发育的影响，本研究以拟南芥snc1突变体、其抑制子突变体mos4snc1和野生型Col-0植株为材料，通过检查其生长表型、叶片细胞数目、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)酶活性与花青素含量，一定程度上反映出SNC1基因突变对snc1植株细胞分生增殖与抗氧化性能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料为野生型拟南芥(Col-0生态型)；snc1突变体和mos4snc1双突变体，由加拿大UBC李昕实验室惠赠。

NBT(Nitro Blue Tetrazolium Chloride，硝基四氮唑蓝)、MET(L-Methionine，L-甲硫氨酸)、愈创木酚等购自博美生物科技有限责任公司；碘化丙啶(PI)、四盐酸精胺购自Sigma公司；正丙醇、核黄素、MES(Methyl Methanesulfonate，甲磺酸甲酯)、纤维素酶(cellulose R10)、离析酶(macerozyme R10)、甘油和β-巯基乙醇购自鹏程生物有限公司；其他常规药品均购自国药集团化学试剂有限公司。

实验所需试剂：种子消毒液使用15%NaClO + 0.1% Tween20进行配置。0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)，首先配置好AB贮备液，分别为贮备液A：0.2 mol/L NaH2PO4溶液，贮备液B：0.2 mol/L Na2HPO4溶液，然后分别取贮备液A 87.7 mL与贮备液B 12.3 mL，充分混匀并稀释定容至200 mL。POD反应混合液的配置是使用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50 mL，过氧化氢(H2O2)28 μL和愈创木酚19 μL充分混匀得到。0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)的配置是分别取贮备液A 8.5 mL与贮备液B 91.5 mL，充分混匀并稀释至200 mL。其他使用到的药剂还有0.026 mol/L蛋氨酸(Met)磷酸钠缓冲液；7.5×104mol/L硝基四氮唑蓝(NBT)溶液；2×10-5mol/L核黄素溶液含1.0 μmol/L EDTA；0.05 mol/L pH7.8磷酸钠溶液；0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.0)等。花青素提取液的配置是由正丙醇∶盐酸∶水=18∶1∶81混合；0.05 mol/L pH7.0磷酸缓冲液；0.2 mol/L H2O2溶液：30% H2O211.36 mL溶于磷酸缓冲液中，定量至250 mL。细胞数目检测用到的试剂按照文献[8]方法配制。

1.2 种子的播种与管理

按照Xia等[9，10]的方法，将适量拟南芥种子用种子消毒液杀菌消毒3～5 min后，用蒸馏水清洗两次，加入0.1%的琼脂糖使种子重悬，在4℃下避光春化3～4 d。分散种入培养钵后再将培养钵放置在光照培养室中培养，培养条件为16 h光照(23℃) + 8 h(21℃)黑暗、湿度40%～50%。

当幼苗长出2～3片真叶时，将幼苗移栽至小培养钵中，每钵4株，并根据土壤水分蒸发情况，每隔2～3 d浇一次水，保持土壤湿润，移盆后约35 d可进行各种生理指标检测。

1.3 细胞数目测定方法

取苗龄约35 d的拟南芥真叶叶片，参照文献[8]的方法用流式细胞仪进行细胞数量检测。

1.4 酶活性检测方法

过氧化物酶(POD)的测定参照文献[11]方法略作修改。幼苗移栽后约35 d，选取长势、大小、形态一致的snc1、mos4snc1和Col-0野生型植株幼苗，每株取第3～8片新鲜真叶共约0.2 g放入研钵中，加入1 mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸缓冲液，在冰上将其研磨成匀浆，用移液器将匀浆转移到2 mL离心管中，再以1 mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸缓冲液冲洗研钵，一并转入同一EP管中。4000 rpm离心5 min，再取上清1 mL至5 mL离心管中，加入3 mL pH7.8磷酸缓冲液，颠倒混匀。而后取1 mL酶液和3 mL POD反应液置于石英比色皿中混匀，反应5 min后测定OD470的光密度值。

超氧化物歧化酶(SOD)的测定参照文献[12]方法略作修改。选取长势、大小、形态较为一致、移栽后约35 d的snc1、mos4snc1和Col-0野生型植株幼苗，每株取第3～8片新鲜真叶共约0.2 g置于研钵中，加入1 mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸缓冲液，于冰上将其研磨成匀浆，用移液器将匀浆转移至2 mL离心管中，再用1 mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸缓冲液冲洗研钵，一并转入2 mL离心管。然后用冷冻离心机在4℃10 000 g离心30 min，取上清定容至4 mL。然后取洁净且干燥的5 mL的微烧杯编号，按表1的顺序加入酶液及各试剂，反应系统总体积为3 mL。充分混匀后，取1个不加酶液的微烧杯对照组置于暗处，作为空白对照调零，再取2个对照组与试验组微烧杯一块放在温度为25℃，光强为6500 Lux的光照箱内，照光处理20 min，然后立即遮光终止反应。在560 nm波长下用暗处理的溶液调零，测定试验组光密度值。

表1 反应系统中各试剂及酶液的加入量(mL)Table 1 The amount of each reagent and enzyme liquid for the reaction system (mL)

过氧化氢酶(CAT)含量的测定参照文献[11]方法略作修改。幼苗移栽后约35 d，选取长势、大小、形态较为一致的snc1，mos4snc1和Col-0野生型植株幼苗，每株取第3～8片新鲜真叶共约0.2 g放入研钵中，加入1 mL 0.05 mol/L pH7.0磷酸缓冲液，在冰上将其研磨成匀浆，用移液器将匀浆转移到2 mL离心管中，再用1 mL 0.05 mol/L pH7.0磷酸缓冲液冲洗研钵，一并转入2 mL离心管中。4000 rpm离心5 min，取上清1 mL至5 mL离心管中，加入3 mL pH7.0磷酸缓冲液，颠倒混匀。取0.1 mL酶液，加入0.05 mol/L pH 7.0磷酸钾缓冲液1.4 mL和40 mmol/L H2O21.5 mL，于石英比色皿中，立即在波长240 nm处检测光密度值，每30 s读数一次，共测定4 min。以不含酶液的待测液作为空白对照。

花青素含量的测定参照Shan等[13]方法稍作修改。幼苗移栽后约35 d，选取长势、大小、形态较为一致的snc1、mos4snc1和Col-0野生型植株，去根，清洗去泥沙，再用滤纸吸干多余水分。取10株植物做为一个样品，称重后放入2 mL带扣的防爆离心管中。加入1 mL提取液，100℃水浴3 min(当心爆管)，用镊子取出样品，遮光暗处理至少12 h。用分光光度计测定样品的A535与A650光密度值。

1.5 数据分析

运用DPS数据处理系统进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 Col-0野生型、snc1和mos4snc1突变体植株形态特征

在同样培养条件下，snc1突变体植株幼苗与Col-0野生型和其抑制子突变体mos4snc1植株幼苗明显不同，snc1突变体幼苗株型矮小，叶片卷曲，成株果荚较Col-0野生型的短，种子较少。而snc1的抑制子突变体mos4snc1植株恢复了其野生型表型(图1)。

为量化这种差异特征，统计分析了移栽后约60 d的Col-0野生型、snc1和mos4snc1突变体植株的株高，叶片长度、宽度，果荚长度和每果荚种子数目等。结果snc1植株比Col-0植株平均矮65.05%，其第3、4片真叶平均长度比Col-0的短53%，叶片

图1 Col-0野生型、snc1和mos4snc1突变体幼苗的形态Fig.1 Morphology of wild type (Col-0)，snc1 and mos4 snc1 seedlings

平均宽度比Col-0的窄51%，角果荚平均短9.48%，平均种子数量少20.69%(表2)。而snc1的抑制子突变体mos4snc1则恢复了野生型表型，与Col-0野生型植株没有显著差异。说明snc1基因突变严重影响了拟南芥植株生长发育，导致植株矮小，叶片变小，果荚变短等表型。

表2 Col-0野生型、snc1和mos4snc1突变体植株的形态指标比较Table 2 Morphological parameters of the wild type Col-0，snc1 and mos4snc1 plants

2.2 SNC1基因突变对snc1植株细胞分生增殖的影响

为进一步检测snc1突变体植株的矮小株型主要是细胞数目减少引起的还是由单个细胞体积变小所引起的，分别检测了植株的第1、2片和第3、4片真叶的细胞数目(图2)。结果表明，野生型Col-0第1、2片真叶的细胞数目平均约为每叶4.95×104个，snc1突变体平均约为每叶2.32×104个，Col-0野生型植株的第1、2片真叶的平均细胞数目是snc1突变体的2.13倍，而mos4snc1突变体平均约为每叶4.39×104个，与野生型植株的第1、2片真叶的平均细胞数目没有显著性差异。Col-0第3、4片真叶的平均细胞数目(平均约为每叶1.12×105)是snc1第3、4片真叶的平均细胞数目(约为每叶4.27×104)的2.62倍，而mos4snc1第3、4片真叶的平均细胞数目约为每叶9.49×104。这表明snc1基因突变导致了叶片细胞数目大幅度减少，其中第1、2叶细胞平均减少了53.14%，而第3、4叶细胞平均减少了61.88%，说明snc1基因突变削弱了植株细胞分裂的增生能力。

图2 野生型(Col-0)、snc1和mos4snc1突变体植株真叶细胞核数目Fig.2 Cell nuclei numbers of the leaves in wild type(Col-0)，snc1 mutant and mos4snc1 mutant plants

2.3 SNC1基因突变对snc1植株细胞抗氧化胁迫酶活性的影响

植物抗性反应的激活常伴随着细胞内氧化还原性状的改变如活性氧迸发。为深入分析SNC1基因突变对植株细胞的抗氧化胁迫性状的影响，分别检测了生长约35 d的拟南芥Col-0野生型、snc1和mos4snc1突变体植株叶片的SOD、POD和CAT酶活性，结果如表3。由表3可知，在同样生长条件下，snc1突变体的SOD、POD、CAT酶活性显著高于Col-0野生型植株的，表明snc1体内因病程相关蛋白的组成型表达导致持续的氧胁迫，因此在一定程度上需要高活性SOD、POD、CAT酶来清除ROS，以帮助突变体植株适应这种氧化胁迫环境。而mos4snc1突变体则抑制了SNC1的组成型表达，恢复了其野生型表型，植株生长也恢复正常，因此mos4snc1突变体的POD、SOD酶活性与野生型植株的POD、SOD酶活性没有显著差别。

2.4 SNC1基因突变对snc1植株细胞花青素积累的影响

植株的抗氧化胁迫能力可能影响到植株体内花青素的积累。统计分析表明，同等生长条件下，snc1、mos4snc1植株中花青素含量显著高于Col-0植株体内花青素含量，而mos4snc1的花青素含量则低于snc1突变体植株，但两者之间没有显著差别(表3)。

表3 SNC1基因突变植株的POD、SOD、CAT酶活性和花青素含量Table 3 Effects of SNC1 gene mutation on enzyme activities of POD，SOD，CAT and Anthocyanins content

3 结论与讨论

拟南芥snc1 (suppressorofnpr1-1，constitutive1)是在研究植物先天免疫反应，筛选npr1(nonexpresserofPRgenes)的抑制子突变体时找到的一个功能获得型点突变体。该突变体中病程相关蛋白如PR1和PR2等持续高表达，对病原微生物的抗性显著增强，并导致snc1突变体叶片卷曲，株型矮小[5]。图位克隆结果表明，该突变基因编码蛋白是植物中的一种TIR-NB-LRR (Toll/interleukin-1 receptor-Nucleotide Binding-Leucine Rich Repeat)类R蛋白，其基因的突变导致氨基酸序列中的一个谷氨酸(Glu)变成了赖氨酸(Lys)，导致SNC1蛋白在snc1突变体中的稳定性增强，从而组成型激活了snc1植株中PR1和PR2等病程相关蛋白高表达。为了探讨SNC1基因突变对植株生长发育的影响，本研究以拟南芥野生型Col-0、突变体snc1植株与其抑制子双突变体mos4snc1为材料，检测基因突变对植物细胞分生增殖的影响和细胞抗氧化性状的影响，发现基因突变导致snc1植株第3、4片真叶平均比Col-0野生型植株的第3、4片真叶短53%、窄51%，植株比野生型植株平均矮65.05%，其角果荚平均短9.48%，平均种子数量少20.69%。说明SNC1基因突变严重影响了拟南芥植株生长发育，导致叶小，植株矮小，果荚变短。而其抑制子突变体mos4snc1则与Col-0野生型植株没有显著差异。

为进一步分析snc1的矮小株型是否由细胞体积变小所引起，本研究通过叶片酶解，细胞裂解和细胞核收集后染色，用流式细胞仪详细检测了Col-0野生型、snc1和mos4snc1双突变体植株的细胞数目，结果显示Col-0植株的第1、2片真叶平均细胞数目是snc1植株第1、2片真叶平均细胞数目的2.13倍，第3、4片真叶的平均细胞数目是snc1第3、4片真叶的2.62倍。而抑制子植株mos4snc1与野生型植株之间没有显著差别，证明SNC1基因突变削弱了植株细胞的分生增殖能力，从而导致细胞数目减少，植株变矮。

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Effects ofSNC1 Gene Mutation on Cell Proliferation and Antioxidation Character inArabidopsisthaliana

MO Xudong1，2，DENG Dongjing3，QIN Lei1，2，CAI Sangji2，MO Yi2，XIA Shitou1，2*

(1 Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development，Changsha，Hunan 410128，China；2 College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；3 International College，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China)

Wild type Col-0，snc1 mutant and its suppressormos4snc1 double mutant plants was used as materials to study the effects ofSNC1 gene mutation on cell proliferation and antioxidation character inArabidopsisthaliana.The results showed that the average plant height ofsnc1 was 65.05% shorter than that of Col-0 wild type plants，with the average blade length and width of the third and 4thtrue leaf reduced by 53% and 51%，average silique length and numbers of seeds per silique reduced by 9.48% and 20.69%，respectively.Compared with the wild type plants，cell number of the first and second true leaves decreased 53.14%，and that of the third and 4thleaves insnc1 mutants decreased 61.88%.The activity of superoxide dismutase (SOD)，peroxidase (POD) and catalase (CAT) enzyme insnc1 mutants was significantly higher than that of the wild type plants.The accumulation of anthocyanin in snc1 was also significantly higher than that of the wild type plants.The mutated phenotype was restored to wild type inmos4snc1 double mutant.As a result，there is no significant difference for the activity of SOD and POD betweenmos4snc1 double mutant and wild type plants.It is suggested that the cell proliferation and antioxidation character is severely affected bySNC1 gene mutation which leads to the cell number reduction and plant drawf with snc1 gene.

Arabidopsis；SNC1；cell division and proliferation；oxidation resistance

2016-05-05

莫旭东(1989-)，男，硕士研究生。 *通信作者：夏石头，教授，Email：xstone0505@163.com。

湖南省自然科学杰出青年基金项目(11JJ1007)。

Q786

A

1001-5280(2016)05-0557-06

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.05.18