实时荧光核酸恒温扩增检测技术在泌尿生殖道淋病中的应用

王彦彬 李瑞鹏 钟春燕 诸靖宇 徐智慧

实时荧光核酸恒温扩增检测技术在泌尿生殖道淋病中的应用

王彦彬 李瑞鹏 钟春燕 诸靖宇 徐智慧

目的 探讨实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT）检测泌尿生殖道淋病的灵敏度、特异度以及监测疗效的实用性。方法 回顾性分析12 816例因怀疑泌尿道淋球菌感染需行淋球菌检测受试者临床资料，其中淋球菌培养检测6 323例，基于SAT开发的淋球菌核酸检测试剂盒（NG-SAT）检测7 107例，比较2种检测方法的阳性率；再以淋球菌培养法为金标准，计算同时行以上2种检测的614例患者NG-SAT检测尿液样本的灵敏度和特异度；对2种检测结果有差别的标本，进行荧光定量DNA杂交及聚合酶链反应法（FQ-PCR）复测与分析；对检测结果阳性的患者进行头孢曲松治疗，待症状消失后3d再次行以上2种检测。结果 NG-SAT检测尿液标本的灵敏度为100.0%，特异度为98.2%。2种检测结果有差别的标本7份，均为SAT检测阳性、淋球菌培养阴性；FQ-PCR复测结果显示6份阳性、1份阴性。179例患者经头孢曲松治疗后，NG-SAT检测阳性15例，淋球菌培养阳性7例。结论 NG-SAT检测尿液中淋球菌简便、准确，且能准确判断预后，值得临床推广应用。

淋病 实时荧光核酸恒温扩增检测技术 淋球菌培养 尿液

我国性传播疾病监测结果表明，淋病发病率在30/ 10万左右[1]；其发病率高、社会危害性大，感染后若不及时治疗，可伴发多种合并症。早期诊断与治疗是控制淋病传播的关键。目前国内仍以淋球菌培养法为主，虽然其准确度高，但采样困难、培养时间长。近年来，新的淋球菌检测方法不断涌现[2-3]，其中实时荧光核酸恒温扩增技术（SAT）是2011年上海仁度公司在RNA恒温扩增技术（TMA）基础上开发的新一代核酸检测技术，可同时检测尿液和拭子，是一种非侵入性检测方法，目前国内已用于临床结核杆菌、解脲脲原体、淋球菌等的检测[4]。本研究以传统淋球菌培养法为金标准，分析基于SAT开发的淋球菌核酸检测试剂盒（NG-SAT）检测泌尿生殖道淋病的灵敏度、特异度以及监测疗效的实用性，为NG-SAT检测的临床推广提供依据。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2012年2月至2015年11月在杭州市第三人民医院就诊、因怀疑泌尿道淋球菌感染而行淋球菌检测的1 2816例受试者临床资料，年龄14～71（33.65±7.33）岁；出现症状时间（7.67±1.29）d；6 323例进行了淋球菌培养，7 107例进行了NG-SAT检测，614例2种方法同时检测[男369例（临床诊断为尿道炎），女245例（临床诊断为尿道炎或宫颈炎）]。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 淋球菌分离培养基购自珠海银科医学工程公司。SAT引物由上海仁度生物工程股份有限公司合成，RNA探针由上海吉玛制药技术有限公司合成，Lightcy cycle 480荧光定量PCR仪购自Roche公司。ABI 7500荧光定量 PCR仪购自美国 Applied Biosystems公司，PCR法试剂盒购自上海复兴长征医学科学有限公司提供。

1.2.2 标本采集 所有临床检验标本均采集于杭州市第三人民医院门诊。（1）培养法标本：用无菌棉签采集男性患者尿道内2～4cm分泌物（尿道拭子），采集女性患者宫颈口内侧0.5～1cm分泌物黏液（宫颈拭子），立即接种于淋球菌选择性培养基（T-M），置于35℃、5%CO2培养箱中培养48h。圆形、凸起、湿润、半透明或灰白为淋球菌特征，氧化酶试验阳性和革兰染色阴性的双球菌判定为淋球菌阳性。（2）SAT法标本：标本采集前2h内不排尿，采集首段尿样约1ml，并与lml尿样保存液（试剂盒提供）混匀获得尿液样本，冻存于-70℃待检。

1.2.3 SAT检测 按照试剂盒说明书要求进行操作，400μl加有尿样保存液的尿液样本与100μl核酸提取液混匀，60℃恒温5min，室温放置10min，依次转移到半自动核酸提取仪上进行提取，核酸RNA提取完成后，吸取30μl扩增检测液（含磁珠）至微量反应管，预热后加酶，在同一温度下（42℃），以RNA为起始模板，通过MMLV反转录酶产生一个双链DNA拷贝，利用T7-RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生100～1 000个RNA拷贝；每个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环带，转至Light Cycler 480荧光定量PCR仪中启动反应程序。反应程序：荧光标记选择羧基荧光素，42℃1min，共40个循环；每分钟收集1次荧光信号，共检测40次。

1.2.4 荧光定量DNA杂交及聚合酶链反应法（FQ-PCR）检测 使用ABI 7500荧光定量PCR仪，对NG-SAT检测结果与淋球菌培养结果有差别的标本、留存的拭子样本进行FQ-PCR复测，按照PCR试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 治疗方法及疗效监测 对614例同时行NGSAT检测和淋球菌培养且至少1种检测结果阳性的患者进行头孢曲松静脉滴注抗感染治疗，剂量2g，疗程3～6d，停药标准为症状消失且尿常规WBC转阴；待症状消失后3d再行NG-SAT检测与淋球菌培养，采样及检测方法同上。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验和Fisher确切概率法；计量资料用表示，组间比较采用t检验。以淋球菌培养法为金标准，计算SAT检测尿液样本、拭子样本的灵敏度和特异度；对2种检测结果有差别的样本，根据Real-time RT-PCR复测结果作进一步分析。

2 结果

2.1 2种方法检测结果 NG-SAT检测阳性率为37.7%（2 679/7 107），高于淋球菌培养阳性率35.9%（2 270/ 6 323），差异有统计学意义（χ2=4.631，P＜0.05）。

2.2 NG-SAT检测灵敏度和特异度 同时行淋球菌培养和NG-SAT检测614例，以淋球菌培养法为金标准，NG-SAT检测灵敏度为100.0%，特异度为98.2%，假阴性率为0.0%，假阳性率为1.8%，阳性预测值为96.9%，阴性预测值100.0%，Kappa值为0.975，见表1。以上2种检测结果有差别的标本有7份，均为NG-SAT检测阳性、淋球菌培养阴性；FQ-PCR复测结果显示6份阳性，1份阴性。

表1 614例同时行淋球菌培养和NG-SAT检测的结果（例）

2.3 疗效监测结果 对227例患者进行头孢曲松抗感染治疗，其中179例症状完全消失后3d门诊复查，NG-SAT检测阳性15例（8.38%），淋球菌培养阳性7例（3.91%），两者差异无统计学意义（P=0.122），见表2。

表2 随访179例同时行淋球菌培养和NG-SAT检测的结果（例）

3 讨论

淋病是我国重点监测与报疫的8种性传播疾病之一[1]。男性淋病可伴有前尿道、后尿道、精囊、附睾等部位炎症，严重者淋球菌可侵入血液而引起败血症；女性淋病可合并上生殖系统感染，如淋菌性盆腔炎、子官内膜炎、输卵管炎、输卵管卵巢囊肿、盆腔脓肿、腹膜炎等[5]。淋病早期检测对病情控制十分重要[6]。目前淋球菌检测主要采集泌尿生殖道分泌物为标本，会给患者带来取样痛苦，降低其检测意愿；此外，在敏感度和特异度亦存在不足[3]。男性淋菌性尿道炎患者发病期尿道口脓液通常较多，在尿道口或较浅尿道取样均可检出阳性；而病程较长者，尿道分泌物可能较少或没有，易造成漏检，因此病程较长者往往淋球菌阳性检出率偏低[7]。NG-SAT是一种可同时检测泌尿生殖道分泌物和尿液标本的非侵入性检查方法，本研究采集受试者的尿液标本进行检测，不仅减轻了患者痛苦，也减少了临床医生的工作量。本研究结果显示NG-SAT检测尿液标本的淋球菌阳性检出率明显高于传统淋球菌培养泌尿生殖道分泌物。以淋球菌培养法为金标准，NG-SAT检测灵敏度为100.0%，特异度为98.2%，假阴性率为0.0%，假阳性率为1.8%，阳性预测值为96.9%，阴性预测值100.0%，kappa值为0.975。在疗效监测方面，淋球菌培养法易受到临床使用抗生素的影响，可能无法在标本培养出细菌，从而出现假阴性结果，影响临床医生对淋球菌治疗效果的判断；而NG-SAT检测不受临床用药干扰，能准确反映出淋球菌患者的治疗效果。本研究经门诊头孢曲松抗感染治疗后复检，有8例患者淋球菌培养阴性而NG-SAT检测结果阳性。

目前，非培养法越来越多应用于淋球菌感染的诊断。TMA是其中一种，其灵敏度高于淋球菌培养法，目前商业化的淋球菌核酸扩增试剂盒己成为诊断淋球菌感染的重要补充。WHO、欧美国家疾控部门均推荐分子诊断法作为首选方法，美国和澳大利亚各级医疗机构检测淋球菌的方法均以TMA为主，其具有扩增效率高的特点，即1h内可将目的基因扩增百万倍以上）和特异度高[8-9]。近来研究表明TMA检测淋球菌的灵敏度高于RT-PCR和bDNA[10]。SAT是在TMA基础上，以RNA为起始模板，通过M-MLV反转录酶产生1个双链DNA拷贝，利用T7-RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100～1 000个）RNA拷贝，每个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环带，有荧光标记的探针与这些RNA拷贝特异性结合而产生荧光。该荧光信号可由荧光PCR仪实时捕获，直观反映扩增产物的产生，避免了国外TMA扩增后杂交显色检测的繁琐[11]。FQ-PCR作为一种核酸检测方法，其敏感度、特异度均较高[12]，但其检测靶标为淋球菌DNA，而DNA在环境中较为稳定，需2～3周才能彻底分解，因此FQ-PCR不能够区分病原体是死菌还是活菌，难以即时判断淋球菌治疗效果[13]。而NG-SAT只检测病原菌体RNA，只有活菌才有完整的RNA片段，故能排除患者治疗后病灶处残留DNA对检测结果的影响；RNA可在死亡的病原体中快速降解，有利于临床用药后的疗效监测，国内已有将SAT应用于结核分支杆菌的治疗与预后判断的研究[14]。此外，RNA在环境中极不稳定、易降解，大大降低了交叉污染引起假阳性的问题，污染概率小。本研究NG-SAT检测结果阳性而淋球菌培养法阴性的7例患者，FQPCR复测结果显示6例阳性，进一步证实NG-SAT检测假阳性率较低。

综上所述，NG-SAT是实验室淋球菌诊断的一种新型检测手段，其检测尿液标本淋球菌的灵敏度和特异度均较高，具有采样方便、耗时短、污染小、结果准确等优点，可用于临床检测与疗效监测。

[1]胡跃华,李镒冲,刘世炜,等.中国20年间淋球菌、性传播衣原体、梅毒螺旋体的发病情况及其疾病负担[J].疾病监测,2015,30(11):904-910.

[2]李新善,胡燕玲,罗明.荧光PCR技术与直接涂片法对淋球菌检测的临床应用分析[J].实验与检验医学,2014,32(2):187-188.

[4]CuiZ,Wang Y,Fang L,et al.Novelreal-time simultaneous amplification and testing method to accurately and rapidly detect mycobacterium tuberculosis complex[J].Journal of clinical microbiology,2012,50(3):646-650.

[5]WorkowskiK A.Centers for disease controland prevention sexually transmitted diseases treatment guidelines[J].Clinical Infectious Diseases,2015,61(Suppl8):S759-S762.

[6]王涛.生殖道感染淋病的现状和规范治疗分析[J].中国医药指南, 2016,14(2):120-120.

[7]马萍,聂庆东,殷敏.3种方法检测淋病奈瑟菌的比较分析及意义[J].中国医药科学,2012,2(9):126-126.

[8]Thorley N,Radcliffe K.The performance and clinical utility of cervical microscopy for the diagnosis of gonorrhoea in women in the era of the naat[J].Internationaljournalof STD&AIDS,2015,26(9): 656-660.

[9]Smith D W,Tapsall J W,Lum G.Guidelines for the use and interpretation of nucleic acid detection tests for neisseria gonorrhoeae in australia:Aposition paper on behalfofthe public health laboratory network[J].2005,29(4):358-365.

[10]MacDonald N,Mailman T,Desai S.Gonococcal infections in newborns and in adolescents[J].Advances in Experimental Medicine&Biology,2008,609(2):108-130.

[11]Chernesky MA,Jang D E.Aptimatranscription-mediated amplification assays for chlamydia trachomatis and neisseria gonorrhoeae[J].Expert review of molecular diagnostics,2006,6(4): 519-525.

[12]Aguilera-Arreola M G,González-Cardel A M,Tenorio A M,et al.Highly specific and efficient primers for in-house multiplex pcr detection of chlamydia trachomatis,neisseria gonorrhoeae, mycoplasma hominis and ureaplasma urealyticum[J].BMC research notes,2014,7(1):433-435.

[13]TabriziS N,Chen S,TapsallJ,et al.Evaluation ofopa-based real-time pcr for detection of neisseria gonorrhoeae[J].Sexually transmitted diseases,2005,32(3):199-202.

[14]程松,李园园,陆俊梅,等.RNA恒温扩增实时检测技术对结核分枝杆菌利福平耐药性的研究[J].中华结核和呼吸杂志,2014,37(5): 328-331.

Detection of urinary Neisseria Gonorrhoea infection with simultaneous amplification and testing technique

WANG Yanbin,LI Ruipeng,ZHONG Chunyan.Department of Urology,Hangzhou Third People's Hospital，Hangzhou 310009,China

Objective To evaluate the application of real-time simultaneous amplification and testing(SAT)technique in detection of urinary Neisseria Gonorrhoea(NG)infection. Methods Total 12 816 patients with suspected urogenital tract infection were tested in our hospital between February 2012 and November 2015,of whom 6 323 were tested by bacterial culture and 7 107 were tested by NG-SAT,and 614 were test by both methods.Swab and urine samples were collected for tests,the swab was tested by liquid culture,while urine samples by SAT.Samples with inconsistent results of two tests were retested by PCR. Results The positive rates of liquid culture and SAT were 35.9%and 37.7%,respectively.The specificity and sensitivity of SAT were 100.0%and 98.2%.In 7 patients with positive SAT and negative culture results,PCR showed 6 of them were positive. Conclusion Detection of NG with SAT technique has high sensitivity and specificity,which provides a new diagnostic method for urinary NG infection.

Neisseria gonorrhoea SAT Culture Urine

2016-04-14）

（本文编辑：陈丹）

杭州市医学重点专科专病项目（20150733Q30）；杭州市卫生计生科技计划项目（2015A20）

310009 杭州市第三人民医院泌尿外科（王彦彬、李瑞鹏、诸靖宇），检验科（钟春燕）；浙江省人民医院泌尿外科（徐智慧）

诸靖宇，E-mail：zjyurology@163.com